小鼠脂肪組織特異表達faT-1基因載體的構建.pdf

1、fat-1基因來源于秀麗隱桿線蟲C.elegans，翻譯產物是ω-3多聚不飽和脂肪酸脫氫酶，此酶的功能是以18-20碳的ω-6PUFAs為底物進行脫氫反應，生成相應的ω-3PUFAs，平衡體內ω-6/ω-3PUFAs的比例，對于預防和治療心腦血管、腫瘤、精神分裂癥等疾病有重要的作用。海洋生物、蔬菜和一些堅果中含有豐富的ω-3PUFAs，而肉類食品中的ω-3PUFAs卻很少，因此，通過飲食方式攝取ω-3PUFAs的效率很低;而哺乳動物體內

2、缺乏合成ω-3PUFAs前體的酶，也缺乏能將ω-6PUFAs轉化為ω-3PUFAs的酶，這使得通過在哺乳動物體內增加外源性的ω-3PUFAs脫氫酶來增加ω-3PUFAs的含量成為一個可取的途徑。秀麗隱桿線蟲屬于真核生物，但是其基因編碼方式更接近于原核生物，為了實現(xiàn)fat-1基因在小鼠脂肪中的表達，本實驗將fat-1基因按照真核生物密碼子偏好性進行了密碼子的優(yōu)化，合成、測序后，采用定向克隆的方法將其重組于pcDNA3.1(+)載體上，構建

3、pcDNA3.1-fat-1(+)真核表達載體。
　　 過去的研究表明，利用轉基因技術可以實現(xiàn)外源基因的非特異性廣泛表達，然而，這種外源基因的非特異性廣泛表達往往會對轉基因動物本身造成負面影響，而這種影響很有可能是由目的基因的異位表達造成的，即外源基因在它原本不表達的組織發(fā)生表達，脫離了正常的生理軸制約，從而使表達產物的生理功能發(fā)生改變。目前，解決異位表達問題的一個有效途徑就是構建外源基因的特異性表達載體，將目的基因的表達限制在

4、單一或少數(shù)必要的組織器官中。這樣既可實現(xiàn)轉基因的目的，又可避免目的基因在不必要的組織器官中表達帶來的負效應。具體到fat-1基因，我們希望它的表達能夠限制在脂肪組織中，對于哺乳動物而言，脂肪酸的合成幾乎都是在脂肪組織內完成的，而同時脂肪組織也是人類消費畜產品的重要形式。
　　 要構建一個特異高效表達的表達載體，啟動予的選擇非常重要。啟動子是一段位于結構基因5'端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地結合并

5、具有轉錄起始的特異性。增強子是指增加連鎖基因轉錄頻率的DNA序列，其通過啟動子增加轉錄。一個增強子并不限于促進某一特殊啟動子的轉錄，其能刺激在它附近的任一啟動子，并且增強子具有組織特異性，例如免疫球蛋白基因的增強子只有在B淋巴胞內活性才最高。除此以外，在胰島素基因和胰凝乳蛋白酶基因的增強子中也發(fā)現(xiàn)有很強的組織特異性。ap2基因編碼一種脂肪組織特異蛋白-脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白(Ap2，p2adipocyteprotein)，有研究表明，

6、該基因轉錄起始位點上游-4.9kb到-5.4kb的518bp的增強子序列是ap2基因組織特異性表達的主要決定元件，-1.7kb到+21bp是該基因有啟動活性的最小啟動子序列。本實驗克隆了ap2基因最小啟動子序列1900bp和518bp的增強子序列，通過酶切連接到EGFP(EhancedGreenFluorescentPortein，EGFP)載體上，構建真核表達載體。通過PCR擴增、酶切電泳分析和測序的方法對重組質粒進行鑒定，并轉染小鼠