小鼠脂肪組織特異表達(dá)faT-1基因載體的構(gòu)建.pdf

1、fat-1基因來源于秀麗隱桿線蟲C.elegans，翻譯產(chǎn)物是ω-3多聚不飽和脂肪酸脫氫酶，此酶的功能是以18-20碳的ω-6PUFAs為底物進(jìn)行脫氫反應(yīng)，生成相應(yīng)的ω-3PUFAs，平衡體內(nèi)ω-6/ω-3PUFAs的比例，對于預(yù)防和治療心腦血管、腫瘤、精神分裂癥等疾病有重要的作用。海洋生物、蔬菜和一些堅(jiān)果中含有豐富的ω-3PUFAs，而肉類食品中的ω-3PUFAs卻很少，因此，通過飲食方式攝取ω-3PUFAs的效率很低;而哺乳動物體內(nèi)

2、缺乏合成ω-3PUFAs前體的酶，也缺乏能將ω-6PUFAs轉(zhuǎn)化為ω-3PUFAs的酶，這使得通過在哺乳動物體內(nèi)增加外源性的ω-3PUFAs脫氫酶來增加ω-3PUFAs的含量成為一個可取的途徑。秀麗隱桿線蟲屬于真核生物，但是其基因編碼方式更接近于原核生物，為了實(shí)現(xiàn)fat-1基因在小鼠脂肪中的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)將fat-1基因按照真核生物密碼子偏好性進(jìn)行了密碼子的優(yōu)化，合成、測序后，采用定向克隆的方法將其重組于pcDNA3.1(+)載體上，構(gòu)建

3、pcDNA3.1-fat-1(+)真核表達(dá)載體。
　　 過去的研究表明，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)外源基因的非特異性廣泛表達(dá)，然而，這種外源基因的非特異性廣泛表達(dá)往往會對轉(zhuǎn)基因動物本身造成負(fù)面影響，而這種影響很有可能是由目的基因的異位表達(dá)造成的，即外源基因在它原本不表達(dá)的組織發(fā)生表達(dá)，脫離了正常的生理軸制約，從而使表達(dá)產(chǎn)物的生理功能發(fā)生改變。目前，解決異位表達(dá)問題的一個有效途徑就是構(gòu)建外源基因的特異性表達(dá)載體，將目的基因的表達(dá)限制在

4、單一或少數(shù)必要的組織器官中。這樣既可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的目的，又可避免目的基因在不必要的組織器官中表達(dá)帶來的負(fù)效應(yīng)。具體到fat-1基因，我們希望它的表達(dá)能夠限制在脂肪組織中，對于哺乳動物而言，脂肪酸的合成幾乎都是在脂肪組織內(nèi)完成的，而同時脂肪組織也是人類消費(fèi)畜產(chǎn)品的重要形式。
　　 要構(gòu)建一個特異高效表達(dá)的表達(dá)載體，啟動予的選擇非常重要。啟動子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地結(jié)合并

5、具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。增強(qiáng)子是指增加連鎖基因轉(zhuǎn)錄頻率的DNA序列，其通過啟動子增加轉(zhuǎn)錄。一個增強(qiáng)子并不限于促進(jìn)某一特殊啟動子的轉(zhuǎn)錄，其能刺激在它附近的任一啟動子，并且增強(qiáng)子具有組織特異性，例如免疫球蛋白基因的增強(qiáng)子只有在B淋巴胞內(nèi)活性才最高。除此以外，在胰島素基因和胰凝乳蛋白酶基因的增強(qiáng)子中也發(fā)現(xiàn)有很強(qiáng)的組織特異性。ap2基因編碼一種脂肪組織特異蛋白-脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(Ap2，p2adipocyteprotein)，有研究表明，

6、該基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-4.9kb到-5.4kb的518bp的增強(qiáng)子序列是ap2基因組織特異性表達(dá)的主要決定元件，-1.7kb到+21bp是該基因有啟動活性的最小啟動子序列。本實(shí)驗(yàn)克隆了ap2基因最小啟動子序列1900bp和518bp的增強(qiáng)子序列，通過酶切連接到EGFP(EhancedGreenFluorescentPortein，EGFP)載體上，構(gòu)建真核表達(dá)載體。通過PCR擴(kuò)增、酶切電泳分析和測序的方法對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，并轉(zhuǎn)染小鼠