CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)羊MSTN基因敲除和定點(diǎn)整合fat-1基因的研究.pdf

1、提高家畜產(chǎn)肉性能，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的肉用家畜新品種是育種工作的目標(biāo)之一，通過(guò)基因編輯技術(shù)可以快速改變特定基因組成，獲得需要的優(yōu)良性狀。MSTN基因?yàn)楣趋兰∩L(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子，該基因的突變會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物肌肉發(fā)達(dá)、體重增加;fat-1基因編碼ω-3多不飽和脂肪酸脫氫酶，可以將多不飽和脂肪酸從ω-6轉(zhuǎn)化為ω-3形式，fat-1基因的增加有利于提高動(dòng)物體內(nèi)ω-3的含量。本研究利用最新的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了敲除山羊MSTN基因的同時(shí)在該

2、位點(diǎn)插入fat-1基因的gRNA載體和fat-1基因定點(diǎn)敲入載體，利用電轉(zhuǎn)法將載體轉(zhuǎn)入絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性單克隆細(xì)胞，通過(guò)體細(xì)胞克隆的方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因絨山羊，期望培育出在提高羊肉產(chǎn)量的同時(shí)增加羊肉中ω-3含量的家畜新品種。
　　1、載體的構(gòu)建
　　本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了2對(duì)基于MSTN基因一號(hào)外顯子的gRNA表達(dá)載體，通過(guò)Survery酶切突變檢測(cè)gRNA2突變效率高于gRNA1;同時(shí)成功構(gòu)建了含有fat-1外源基因且可

3、以定點(diǎn)整合至宿主基因組MSTN位點(diǎn)的敲入載體5'h-pCAGDNA3-fat-1-3'h。
　　2、轉(zhuǎn)基因單克隆細(xì)胞系的篩選
　　本實(shí)驗(yàn)使用電轉(zhuǎn)法將線性化的fat-1載體、gRNA2和Cas9載體按比例轉(zhuǎn)入羊胎兒成纖維細(xì)胞中，通過(guò)流式細(xì)胞儀和口吸管2種方法挑取單克隆細(xì)胞。共成功獲得156株單克隆細(xì)胞，經(jīng)過(guò)PCR和測(cè)序鑒定，其中在MSTN基因位點(diǎn)定點(diǎn)整合fat-1基因的細(xì)胞系40株，外源基因整合效率為25.64％。