利用轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因綿羊相關(guān)技術(shù)研究.pdf

1、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文利用轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因綿羊相關(guān)技術(shù)研究姓名：王海申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：動(dòng)物遺傳育種與繁殖學(xué)指導(dǎo)教師：吳常信李寧20030601摘要本文系統(tǒng)地研究了利用體細(xì)胞克隆技術(shù)來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因綿羊的幾個(gè)主要技術(shù)環(huán)節(jié)，以便建立轉(zhuǎn)基因和核移植操作程序主要內(nèi)容包括轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的建立、激活、融合參數(shù)的優(yōu)化以及供體核和受體細(xì)胞質(zhì)對(duì)核移植胚胎發(fā)育的影響。首先從3個(gè)30日齡綿羊胎兒分離出成纖維細(xì)胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)建立了SFFI、SF

2、F2和SFF3細(xì)胞系。胎兒成纖維細(xì)胞有生長快、數(shù)量多、傳代多等特點(diǎn)。染色體倍性檢測(cè)表明，前20代沒有明顯變化，染色體倍性正常率均在70％以上選用報(bào)告基因GFP轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞優(yōu)化電穿孔法和磷酸鈣沉淀法的轉(zhuǎn)染條件。電穿孔法最佳轉(zhuǎn)染條件為：采用場(chǎng)強(qiáng)125kV／cm。脈沖時(shí)程15ms，電導(dǎo)介質(zhì)為Dhanks，DNA用量為4“g／ml。對(duì)數(shù)期細(xì)胞密度為10L107個(gè)／ml，電擊后在4“C下分別靜放10min能獲得最佳轉(zhuǎn)染效果。磷酸鈣沉淀法最佳

3、轉(zhuǎn)染條件為：2HBS溶液最佳的PH為697I，在37“(2下，加入64119／mlDNA，甘油休克7分鐘，轉(zhuǎn)染24小時(shí)克隆株數(shù)最多，效果最佳。采用電穿孔法成功地敲除Myostatin，以轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞數(shù)來計(jì)算轉(zhuǎn)染率約為1礦，形成純合子概率約為1510‘8。在孤雌激活方面，采用電脈沖時(shí)程為80ps，場(chǎng)強(qiáng)為12kvlcm能有效激活卵母細(xì)胞；在50uM離子霉索內(nèi)處理5分鐘，能獲得最佳的激活效果激活率為909％；在7％乙醇內(nèi)處理7分鐘可達(dá)到最大激

4、活率918％。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，離子霉素和電脈沖對(duì)綿羊卵母細(xì)胞激活較乙醇更為有效。為了探索核移植技術(shù)中電融合參數(shù)，對(duì)綿羊2期胞胚胎的融合進(jìn)行了研究，在脈沖時(shí)程40us150uS，場(chǎng)強(qiáng)為22kv／cm下，能有效地融合綿羊2細(xì)胞胚胎細(xì)胞，可獲得704％771％融合率。為了克服綿羊816細(xì)胞胚胎發(fā)育的阻斷，采用KSOM作為發(fā)育液效果好于SOF；在不同階段使用含有不同蛋白質(zhì)的發(fā)育液超過16細(xì)胞的胚胎百分率為461％，高于單獨(dú)使用一種蛋白質(zhì)，它們差異顯著

5、(p如05)；添加IOng／mIFOF和50umol／mL?；撬崮茱@著提高超過16細(xì)胞胚胎發(fā)育率，可達(dá)626％。受體卵母細(xì)胞和供體核的準(zhǔn)備是核移植成功的關(guān)鍵。在受體方面，卵齡為18—20小時(shí)，去核率晟高，可達(dá)716％；用經(jīng)產(chǎn)母羊卵母細(xì)胞為受體好于用育成羊卵母細(xì)胞為受體細(xì)胞，前者的重構(gòu)胚囊胚率為157％后者重構(gòu)胚囊胚率為29％二者差異顯著(P005)；血清饑餓與非血清饑餓的細(xì)胞做供體核，桑椹胚I囊胚發(fā)育率沒有顯著差異；用005uM秋水仙素

6、處理供體細(xì)胞效果最好，桑椹，囊胚率可達(dá)350％，而未處理或用01uM秋水仙索處理供體細(xì)胞，桑椹壤胚率分別為171％和121％，它們與005uM處理差異顯著(P005)，可見005uM秋水仙素是最佳處理濃度；以GFP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系作為供體，獲得81個(gè)重構(gòu)胚，沒有得到囊胚。綜上所述，我們基本上建立了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的實(shí)驗(yàn)操作程序，獲得了各個(gè)環(huán)節(jié)的技術(shù)參數(shù)，但效率低下，重構(gòu)胚發(fā)育能力弱，仍需進(jìn)一步丈量的研究。關(guān)鍵詞：綿羊，核移植胎兒成纖維細(xì)胞