短葉老鸛草素抗腫瘤活性及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：探索短葉老鸛草素的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制，為其在腫瘤治療的開發(fā)應(yīng)用方面提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：以人肺癌A549細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞、人宮頸癌Hela細(xì)胞、人黑色素瘤A875細(xì)胞、小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞為受試對象，采用MTT法檢測不同濃度的短葉老鸛草素作用48 h對A549、HepG2、Hela、A875、CT26細(xì)胞增殖的影響；選擇抑制效果較好的 CT26細(xì)胞作為研究對象，利用BALB/c小鼠建立CT26實體瘤模型，

2、觀察短葉老鸛草素對小鼠體重、CT26腫瘤生長和臟器指數(shù)的影響；免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織cleaved-caspase-3及LC3-Ⅱ的表達(dá)情況；應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測短葉老鸛草素處理CT26細(xì)胞72 h后細(xì)胞的凋亡情況；Western Blot分析不同濃度的短葉老鸛草素對CT26細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；激光共聚焦觀察短葉老鸛草素作用下 CT26細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白 LC3的表達(dá)和分布。
　　結(jié)果：

3、短葉老鸛草素對人肺癌 A549細(xì)胞、人肝癌 HepG2細(xì)胞、人宮頸癌Hela細(xì)胞、人黑色素瘤A875細(xì)胞、小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞均有較好的增殖抑制作用，并呈現(xiàn)劑量依賴性，IC50值分別為5.98、5.72、4.41、8.17、3.28μg/mL，其中短葉老鸛草素對小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞增殖抑制效果最好，故后續(xù)實驗以CT26作為研究對象。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，短葉老鸛草素組及Adriamycin組小鼠體重具有顯著性差異（P＜0.

4、01），且 Adriamycin組小鼠體重顯著下降；與模型組比較，短葉老鸛草素組及 Adriamycin陽性對照組的瘤重減輕，具有顯著性差異（P＜0.01、P＜0.05）；短葉老鸛草素組瘤重與 Adriamycin組比較，具有極顯著性差異（P＜0.01）。短葉老鸛草素組的肝臟、腎臟指數(shù)與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01、P＜0.05），而脾臟指數(shù)與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義；Adriamycin組的肝臟、脾臟、腎臟指數(shù)與模型組比較，具

5、有極顯著性差異（P＜0.01）；Adriamycin組的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均低于短葉老鸛草素組，并具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01，P＜0.01）。與模型組相比較，短葉老鸛草素組及Adriamycin組腫瘤組織中cleaved-caspase-3及LC3-Ⅱ的表達(dá)上調(diào)；短葉老鸛草素組與 Adriamycin組比較，短葉老鸛草素組蛋白表達(dá)的上調(diào)更加顯著。
　　CT26細(xì)胞的凋亡率隨著短葉老鸛草素濃度的提高而上升，各濃度組細(xì)胞的凋亡率均高

6、于2μg/mL的Adriamycin組。4μg/mL短葉老鸛草素處理組細(xì)胞凋亡率（42.92％）與2μg/mL處理組（45.55%）相當(dāng)，而4μg/mL處理組細(xì)胞晚期凋亡率（33.29%）顯著高于2μg/mL處理組（9.63%）。
　　CT26細(xì)胞內(nèi)cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和Bax的表達(dá)隨短葉老鸛草素濃度升高而升高，Bcl-2蛋白表達(dá)隨其濃度升高而降

7、低；p-PI3K、p-AKT和 p-mTOR蛋白的表達(dá)隨短葉老鸛草素濃度升高而降低，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg5的表達(dá)隨其濃度升高而升高。激光共聚焦結(jié)果顯示短葉老鸛草素可誘導(dǎo)自噬標(biāo)志蛋白 LC3聚集，促使自噬體形成；而短葉老鸛草素和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素共同處理CT26細(xì)胞可增強(qiáng)LC3的聚集，短葉老鸛草素與自噬抑制劑3-MA共同處理CT26細(xì)胞明顯減少LC3的聚集。
　　結(jié)論：短葉老鸛草素在體內(nèi)、體外能夠顯著抑制小