靈菌紅素Uncedylprodigiosin抗腫瘤活性機(jī)制研究.pdf

1、靈菌紅素是一類發(fā)現(xiàn)于多種細(xì)菌、放線菌中的紅色抗生素,由一些放線菌、沙雷氏菌及其它細(xì)菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,包括prodigiosin,prodigiosin 25-C,metacycloprodigiosin(MP),desmethoxyprodigiosi,uncedylpmdigiosin(UP),Cycloprodigiosin(CPIG)等。其中,UP已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有免疫抑制活性,但其抗腫瘤活性研究較少。
　　 前期初步的活

2、性篩選發(fā)現(xiàn)UP能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖,其中對P388細(xì)胞的抑制作用尤為明顯。本文進(jìn)一步檢測UP對P388細(xì)胞的抑制作用,并對其作用機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 MTT法測定UP對小鼠白血病細(xì)胞P388的增殖抑制作用,發(fā)現(xiàn)UP能顯著抑制P388細(xì)胞的增殖,IC50為42 nM,流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示UP將P388細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,并且引起細(xì)胞核DNA剪切;同時,UP能引起周期素Cyclin B1表達(dá)量增加

3、。進(jìn)一步采用Westernblot檢測PARP的裂解情況,PARP的檢測結(jié)果和DNA含量的檢測結(jié)果都顯示UP誘導(dǎo)P388細(xì)胞發(fā)生凋亡;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位,發(fā)現(xiàn)UP使細(xì)胞的降低;進(jìn)一步觀察了UP對P388細(xì)胞線粒體Cyt C釋放以及Caspase-8、9、3剪切的影響,發(fā)現(xiàn)UP能引起P388細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C釋放到胞漿并且使Caspase-8、9、3發(fā)生剪切,表明死亡受體途徑和線粒體途徑參與了UP誘導(dǎo)的P388細(xì)胞凋亡。

4、r>　　 為了進(jìn)一步探討。UP誘導(dǎo)P388細(xì)胞凋亡的機(jī)制,首先應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡對UP進(jìn)行細(xì)胞定位;采用Western Blot法對上游的細(xì)胞信號分子AKT、MAPK家族成員進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)UP對AKT激活無影響,但能明顯促進(jìn)信號分子ERK、P38和JNK的活化;引入ERK、P38和JNK的抑制劑,發(fā)現(xiàn)ERK抑制劑不能逆轉(zhuǎn)UP引起的增殖抑制而P38和JNK抑制劑能明顯逆轉(zhuǎn)UP引起的細(xì)胞增殖抑制,同時發(fā)現(xiàn)ERK抑制劑對UP導(dǎo)致的P3

5、88周期阻滯無明顯影響,而JNK及P38抑制劑對UP導(dǎo)致的P388周期阻滯有恢復(fù)作用。流式細(xì)胞儀法測定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的變化,發(fā)現(xiàn)UP使P388細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量僅少量增加,氧化抑制劑NAC不能逆轉(zhuǎn)UP引起的增殖抑制。采用pH值探針流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)pH的變化;同時采用AO染色觀察細(xì)胞內(nèi)的酸性細(xì)胞器的變化;結(jié)果發(fā)現(xiàn)UP能夠降低P388細(xì)胞內(nèi)的pH值,并且使AO染色后的酸性細(xì)胞器消失;引入酸化抑制劑咪唑,發(fā)現(xiàn)其不能夠逆轉(zhuǎn)UP引起的增殖抑

6、制。非變性電泳法分離出細(xì)胞內(nèi)與UP結(jié)合的蛋白,分離出的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜檢測;質(zhì)譜鑒定出的951種蛋白進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其中171種是核糖體相關(guān)蛋白,推測UP進(jìn)入P388細(xì)胞后可能和核糖體結(jié)合,接下來采用核糖體蛋白L3的抗體對細(xì)胞中的化合物UP進(jìn)行共定位觀察,發(fā)現(xiàn)核糖體和化合物UP有較好的共定位,說明UP進(jìn)入P388細(xì)胞后可能是和核糖體結(jié)合。研究結(jié)果表明:UP通過誘導(dǎo)P388細(xì)胞凋亡而發(fā)揮增殖抑制作用,UP誘導(dǎo)P388細(xì)胞凋亡與MAPK激活及G