手性釕(Ⅱ)配合物Λ-OMe靶向抗腫瘤活性及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　端粒酶是影響腫瘤細(xì)胞復(fù)制增殖的重要標(biāo)志物，腫瘤的無限增殖與端粒酶激活或端粒維持機(jī)制的改變有關(guān)。本文從端粒及端粒酶活性、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡方面研究手性釕(Ⅱ)配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用途徑，闡明手性異構(gòu)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性選擇作用，明確其抗腫瘤作用靶點(diǎn)，為開發(fā)抑制端粒酶活性的高效低毒的抗腫瘤藥物提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.篩選細(xì)胞和手性釕(Ⅱ)配合物。培養(yǎng)細(xì)胞，通過MTT法檢測相應(yīng)細(xì)胞和藥物。用篩選

2、出的藥敏作用最好的手性釕(Ⅱ)配合物和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行下一步檢測。
　　2.端粒及端粒酶活性檢測。通過Western Blotting法檢測手性釕(Ⅱ)配合物對(duì)端粒相關(guān)蛋白Trf1、Trf2的表達(dá);通過TRAP-PCR銀染法檢測手性釕(Ⅱ)配合物對(duì)端粒酶活性的影響。
　　3.細(xì)胞周期檢測。通過PI單染法檢測手性釕(Ⅱ)配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞周期阻滯的影響;通過RT-PCR檢測其對(duì)周期重要調(diào)控因子p21mRNA表達(dá)的影響。
　　4

3、.細(xì)胞凋亡檢測。通過hoechest33342染色、Tunnel法檢測細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn);通過AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法定量檢測細(xì)胞凋亡;通過RT-PCR檢測手性釕(Ⅱ)配合物對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.MTT檢測:手性釕(Ⅱ)配合物Δ/Λ-[Ru(phen)2p-MOPIP]2-（Δ/Λ-OMe）及外消旋體[Ru(phen)2p-MOPI

4、P]2+（dl-OMe）對(duì)被檢測的腫瘤細(xì)胞都有療效，其中手性釕(Ⅱ)配合物Λ-OMe對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803最為敏感。Λ-OMe作用MGC-80348小時(shí)的IC50為7.4μg/ml，且Λ-OMe誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞死亡有明顯的劑量和時(shí)間依賴性。
　　2.端粒及端粒酶活性檢測:手性釕(Ⅱ)配合物Λ-OMe能影響端粒相關(guān)蛋白的表達(dá)并抑制端粒酶活性，且隨藥物濃度增高，端粒酶活性越小。Λ-OMe處理MGC-803細(xì)胞48小時(shí)后，隨著藥

5、物濃度的增加Trf1的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)增加的趨勢，Trf2蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)下降的趨勢;而TRAP-PCR銀染法檢測顯示未加藥物處理組（A條帶）端粒酶條帶最多且顏色最深;陰性對(duì)照組（B條帶）條帶最少，顏色最淺;C、D、E條帶分別為5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml濃度組，隨著藥物濃度增高，條帶減少，顏色變淺。
　　3.細(xì)胞周期檢測:手性釕(Ⅱ)配合物Λ-OMe能阻滯細(xì)胞周期，且周期阻滯在G0/G1期。加入配合物Λ-OMe24小時(shí)

6、后，G0/G1期細(xì)胞數(shù)隨著藥物濃度增加比例增高;S期細(xì)胞數(shù)隨著藥物濃度增加而降低。周期相關(guān)基因結(jié)果顯示，在同一時(shí)間內(nèi)，隨藥物濃度增高，p21mRNA的表達(dá)上調(diào)，但在24和48小時(shí)結(jié)果比較，無明顯的時(shí)間依賴性。
　　4.細(xì)胞凋亡檢測:手性釕(Ⅱ)配合物Λ-OMe能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，且有時(shí)間、劑量依賴性。手性釕(Ⅱ)配合物Λ-OMe處理MGC-803細(xì)胞48小時(shí)后，未加藥物處理組細(xì)胞生長良好，藥物處理組細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量減少，核皺縮，核

7、碎裂、凋亡小體等凋亡細(xì)胞形態(tài)，隨藥物作用時(shí)間延長及濃度增高，細(xì)胞的凋亡率增高;手性釕(Ⅱ)配合物隨著藥物濃度升高，MGC-803細(xì)胞的BaxmRNA、Caspase-3mRNA表達(dá)上調(diào)，Bcl-2mRNA的表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　手性釕(Ⅱ)配合物Λ-OMe對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803具有明顯的抗腫瘤作用，其機(jī)制主要包括:
　　1.阻滯細(xì)胞周期以抑制MGC-803細(xì)胞的增殖，周期阻滯在G0/G1期。
　　2.調(diào)節(jié)