小腸黏膜下層細胞外基質水凝膠的制備及其對肝組織損傷修復的影響.pdf

1、研究背景：
　　小腸黏膜下層(small intestinal submucosa, SIS）細胞外基質（extracellular matrix, ECM）是將小腸去除漿膜層、肌層及黏膜層，以及一系列加工和消毒處理后，獲得的一種不含細胞的細胞外基質。SIS是一種理想的組織工程學生物材料，在機體組織修復方面具有以下三個方面的生物學優(yōu)勢：1.具有組織相容性，SIS主要由Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白構成，并含有豐富的纖維連接蛋白及生長因子，即使經(jīng)

2、過一系列加工處理后SIS仍還有這些生長因子。如成纖維細胞生長因子-2、轉移生長因子-β、血管內皮生長因子、血小板源性生長因子等,這些物質均為正常細胞外基質的成分。其中Ⅰ型膠原蛋白及纖維連接蛋白均可于細胞膜特異性結合，并激活細胞傳導通路促進細胞的粘附，而其他各種生長因子也可以刺激細胞增殖。因此，SIS不僅能為宿主細胞提供較佳黏附和遷移的自然環(huán)境，還能很快與宿主組織結合，促進血管生成，恢復組織功能。2.具有免疫原性和安全性，經(jīng)過機械法和化學

3、法聯(lián)合處理的SIS不含細胞，其攜帶病原體的概率很低，而且其免疫原性弱，即使異種移植后亦不產(chǎn)生排斥反應。SIS經(jīng)消毒處理后，所含有的各種組分不會丟失或失活，超微結構及機械特性無明顯改變。因此，經(jīng)消毒處理后SIS具有較高的安全性。同時SarikayaA等指出SIS浸出液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制作用，可以抑制細菌的生長。3.具有生物力學性能，小腸黏膜下層是一種非線性材料，在縱軸方向（無論是否刨開管壁）的抗拉伸強度相當于肌腱和韌帶組

4、織的1/7到1/4。SIS作為體內組織工程的材料，具有適當?shù)臋C械特性，能承受周圍組織壓力，為再生細胞提供足夠的生長空間。因為其良好的生物學優(yōu)勢，SIS已經(jīng)廣泛應用于現(xiàn)代生物材料和組織工程醫(yī)學領域，如肌腱重建、下泌尿道重建、硬腦膜修補、血管重建、修復部分或全層皮膚損傷等。目前關于SIS在肝臟組織損傷修復方面的研究較少，但其具有較大的研究價值和應用潛力。因此，本研究使用豬小腸自制小腸黏膜下層細胞外基質，通過制備豬小腸黏膜下層（SIS）細胞外

5、基質水凝膠，注射至由四氯化碳（CCL4）誘導肝損傷的損傷部位，以研究SIS細胞外基質水凝膠材料對化學性肝損傷的修復作用。通過探討注射性SIS細胞外基質水凝膠材料治療化學性肝損傷的可行性，為臨床上針對急、慢性肝損傷的修復和治療提供依據(jù)和新的方法。
　　方法：
　　1.取新鮮豬小腸組織，運用SDS脫細胞和酶消化方法，制備小腸黏膜下層細胞外基質水凝膠；利用H&E染色方法檢測基質材料脫細胞效果；并檢測制作的水凝膠材料的溫度敏感性；M

6、TT方法檢測水凝膠材料對人正常肝細胞的生物相容性。
　　2.培養(yǎng)人正常LO2肝細胞，分為正常對照組、CCL4損傷組、水凝膠處理CCL4損傷細胞組，采用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況，EdU細胞增殖染色法檢測各組細胞的增殖情況，ELISA方法檢測各組細胞培養(yǎng)上清中bEGF、VEGF、NGF、IL-4、IL-6、IL-8含量的變化，以檢測自制小腸黏膜下層細胞外基質水凝膠對CCL4損傷肝細胞的修復作用。
　　3.采用經(jīng)腹膜連續(xù)3

7、個月注射四氯化碳法，建立C57/BL小鼠化學性肝損傷模型。在B超引導下，用31G注射針將自制小腸粘膜下基質水凝膠注射至損傷肝包膜下。收集處理后小鼠的血清和肝組織，觀察SIS水凝膠對實驗小鼠血清白蛋白（ALB）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、以及肝組織病理改變的影響。
　　結果：
　　通過SDS處理和酶消化方法后，H&E檢測發(fā)現(xiàn)可以完全除掉豬小腸黏膜組織外的細胞，從而成功制備了豬小腸細胞外基質水凝

8、膠材料，并具有明顯的溫度敏感性和生物相容性。流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，小腸細胞外基質水凝膠材料能夠減少CCL4誘導的損傷肝細胞凋亡；而EdU檢測方法發(fā)現(xiàn)小腸細胞外基質水凝膠材料能夠促進CCL4誘導的損傷肝細胞的增殖；ELISA檢測發(fā)現(xiàn)小腸細胞外基質水凝膠材料能夠促進肝細胞培養(yǎng)環(huán)境中bEGF、VEGF、NGF細胞因子含量，并減少促炎因子IL-6、IL-8的產(chǎn)生，而增加抗炎因子IL-4的產(chǎn)生。利用CCL4建立C57/BL小鼠肝損傷模型，成功在B超

9、引導下將自制小腸粘膜下基質水凝膠注射至損傷肝包膜下，經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)水凝膠處理組小鼠血清中ALB顯著上升，而ALT和AST轉氨酶的含量顯著下降，而H&E檢測也發(fā)現(xiàn)，豬小腸黏膜下層細胞外基質水凝膠注射有助于損傷肝組織的形態(tài)恢復。
　　結論：
　　本研究成工制備豬小腸細胞外基質水凝膠，檢測發(fā)現(xiàn)其具有溫敏性和生物相容性，并能夠通過改善相關細胞因子分泌含量，促進損傷肝細胞增殖并抑制其凋亡，從而減輕肝細胞損傷，并能夠注射至肝損傷小鼠體內，