右美托咪定對腎缺血-再灌注（缺氧-復氧）損傷的保護作用及部分機制.pdf

1、背景：
　　右美托咪定(Dex)做為一個高效、高選擇的α2受體激動劑，由于其具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎和利尿等積極作用，同時無明顯的呼吸抑制及腦電干擾等副作用，目前在臨床中以麻醉輔助用藥的身份得到了廣泛的應用，在心臟手術中，Dex表現(xiàn)出了能夠減少麻醉藥物的需要量，增強血液動力學的穩(wěn)定性和提供心臟手術后患者的鎮(zhèn)靜作用等方面的優(yōu)勢。隨著Dex在心臟手術中的廣泛應用，Dex表現(xiàn)出可以降低CPB下心臟手術患者的術后肺損傷和腦損傷的發(fā)生率及減輕術

2、后肺損傷和腦損傷的程度。然而，Dex對CPB下心臟手術患者的腎保護作用的安全性和有效性仍存在爭議。Sugita S等報道在動物模型中，Dex可減輕大鼠腎缺血再灌注損傷，然而Kari等卻報道在臨床中Dex僅增加了尿量，并沒有對腎臟產(chǎn)生保護作用。
　　心臟直視手術大多需要在體外循環(huán)(CPB)輔助下完成，但CPB過程中引起的小栓子脫落、非生理性灌注及炎癥反應等可導致腎組織局部產(chǎn)生不同程度的缺血，再灌注被認為是缺血的必要挽救措施，但是隨著

3、研究的深入發(fā)現(xiàn)缺血后再灌注反而加重原來缺血器官的損傷，所以CPB下心臟手術后，腎臟遭受著缺血及缺血后再灌注等多重打擊，最終有可能引起術后不同程度的急性腎損傷(AKI)。腎小管上皮細胞是腎臟主要實質細胞，與其它腎單位相比其最容易發(fā)生缺血性損傷，腎H/R損傷很容易導致腎小管上皮細胞凋亡。AKI是一種發(fā)病率及死亡率極高和使醫(yī)療費明顯增加的全球公共衛(wèi)生問題。臨床研究表明CPB下心臟瓣膜置換術是心臟手術后AKI發(fā)生的一個獨立危險因素。實施合理的腎

4、保護策略具有重要意義，麻醉藥物的選擇和合理使用是圍術期實施腎保護策略的一個重要方面。對于CPB下心臟瓣膜置換術，這一術后高發(fā)AKI的手術類型，Dex是否具有腎保護作用，降低術后AKI的發(fā)生率尚未見報道。
　　內質網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER):與各種膜蛋白、分泌蛋白、和磷脂膽固醇代謝相關的真核細胞內的最大細胞器，是細胞內折疊蛋白的場所。內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，E

5、RS):過度的氧化應激、缺血再灌注和鈣離子濃度改變等病理生理改變時均可導致ER功能發(fā)生紊亂，細胞對ER功能的需求超過其自身能力，在ER內出現(xiàn)未折疊或錯誤折疊的蛋白質聚集以及Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡的病理狀態(tài)。適度的ERS是細胞的自我保護性機制，其能夠觸發(fā)哺乳類動物真核細胞內的一種保護性應激反應即未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)，最終恢復內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)以使細胞生存;但是過強或過長時間的ERS則可能導致細胞凋

6、亡或壞死，從而造成組織和器官受損。在缺血缺氧、葡萄糖缺乏、鈣濃度變化以及氧化應激等病理情況時則能誘發(fā)ERS，這是啟動細胞凋亡的重要途徑之一。研究表明ERS參與心、腦、腎等重要器官缺血再灌注損傷的病理生理過程。但Dex對腎臟的保護作用是否與ERS途徑有關尚不清楚。
　　脂質過氧化反應是指機體必須的多不飽和脂肪酸在體內氧化酶的作用下生成了一系列生物活性物質，同時也產(chǎn)生了大量氧自由基。增高的氧自由基不僅可以直接氧化脂質以及蛋白質和DNA

7、等生物大分子，還可以作為信號分子引起細胞內外信號傳導通路的異常，導致人體正常細胞和組織的損壞，從而引起多種疾病。圍術期腎損傷的發(fā)病率不斷上升，以缺血再灌注腎損傷最為多見，常發(fā)生于腎移植、CPB下心臟手術后、創(chuàng)傷、失血性休克及膿毒血癥等疾病基礎下，有研究表明腎損傷的發(fā)病機制除了與ATP的減少、細胞凋亡基因的調控和細胞內鈣超載外，與大量氧自由基的產(chǎn)生也有著密切關系。所以脂質過氧化反應過程中產(chǎn)生的大量氧自由基在缺血性腎損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要

8、意義，許多減輕腎缺血再灌注的因素亦可以通過抑制脂質過氧化反應而發(fā)揮腎保護作用。目前，有關脂質過氧化反應是否參與Dex對腎缺血再灌注的保護作用尚無定論。
　　目的：
　　本研究分臨床試驗和細胞實驗兩部分。
　　第一部分 臨床試驗部分
　　1.通過給予CPB下瓣膜置換術患者Dex干預后，檢測患者各時點的血清中NGAL和尿IL-18的水平，BUN和Cr的濃度，同時記錄術中、術后1d和術后2d患者的尿量，診斷并記錄患者術

9、后AKI的發(fā)生情況，評估Dex對患者腎功能及術后AKI發(fā)生率的影響。
　　2.測定患者各時點的血清中MDA濃度和SOD活性，了解脂質過氧化反應是否參與Dex對CPB下瓣膜置換術患者腎功能的影響。
　　第二部分 細胞實驗部分
　　1.通過給予腎小管上皮細胞(HK-2細胞)Dex培養(yǎng)后，測定細胞活力及細胞凋亡率，評估Dex對缺氧復氧誘導HK-2細胞凋亡的保護作用
　　2.通過測定經(jīng)不同培養(yǎng)方式后的HK-2細胞GRP7

10、8、CHOP、caspase-12和活化caspase-3的表達水平及MDA濃度和SOD活性，探討ERS和脂質過氧化反應在Dex腎保護作用中的潛在機制。
　　方法：
　　第一部分 臨床試驗部分
　　右美托咪定對CPB下瓣膜置換術患者術后急性腎損傷的發(fā)生率及腎功能的影響:一項雙盲、隨機、對照研究
　　擇期CPB下心臟瓣膜置換術患者入選了本隨機、前瞻性、安慰劑對照和雙盲試驗。性別不限，年齡18～65歲，ASA分級Ⅱ或

11、Ⅲ級，NYHA分級Ⅱ-Ⅲ級，采用電腦隨機數(shù)字表法，將其分為兩組:對照組（Placebo組）和右美托咪定組(Dex組)。麻醉誘導前Dex組靜脈注射4.0μg/ml的右美托咪定0.6μg/kg(給藥時間15min)，隨后以0.2μg·kg-1·h-1速率輸注至術畢，Pacebo組給予等容量的生理鹽水。分別于麻醉誘導前(T1)、手術結束時(T2)及術后12h、24h和72h(T3-5)留取頸內靜脈血樣和尿液，采用ELISA法測定NGAL和尿I

12、L-18的水平及測定MDA濃度和SOD活性，并測定血清中尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)的濃度，同時記錄術中、術后1d和術后2d患者的尿量，記錄患者術后急性腎損傷等圍術期不良事件的發(fā)生情況。
　　第二部分 細胞實驗部分
　　內質網(wǎng)應激在右美托咪定對缺氧復氧誘導人腎小管上皮細胞凋亡中的作用
　　將培養(yǎng)成功的人腎小管上皮細胞系（HK-2細胞），采用隨機數(shù)字表法，將其分為4組(n=5):正常對照組（C組）:置于37℃常氧恒溫細

13、胞培養(yǎng)箱28h;右美托咪定組(Dex組):終濃度0.1nmol/L的Dex孵育2h，隨后置于37℃常氧恒溫細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)28h;缺氧/復氧組（H/R組）:置于37℃的厭氧培養(yǎng)罐中缺氧24h后，隨后置于37℃常氧恒溫細胞培養(yǎng)箱進行復氧4h;Dex+缺氧/復氧組（各Dex+H/R組）:用終濃度0.1nmol/L的Dex孵育2h，隨后置于37℃的厭氧培養(yǎng)罐中缺氧24h后置于37℃常氧恒溫細胞培養(yǎng)箱進行復氧4h。各組培養(yǎng)結束后采用MTT法檢

14、測細胞活力，計算細胞存活率，流式細胞儀檢測凋亡率。Western blot法檢測GRP78、CHOP、caspase-12和活化caspase-3的表達并測定細胞丙二醛(MDA)濃度和超氧化物歧化酶(SOD)活性。
　　結果：
　　第一部分 臨床試驗部分
　　最終共有72例患者完成本項試驗，兩組患者一般資料各指標及術中情況各指標的比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與T1（麻醉誘導前）比較，兩組T5時(術后72h)血

15、清BUN和Cr的濃度升高，T3,4時(術后12h和24h)血清NGAL和尿IL-18的水平升高，T2,3時(手術結束時和術后12h)血清MDA濃度升高，SOD活性降低(P＜0.05）。與Placebo組比較，Dex組T5時(術后72h)血清BUN和Cr的濃度降低，T3,4時(術后12h和24h)血清NGAL水平降低(P＜0.05），兩組各時點尿IL-18水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，T2,3時(手術結束時和術后12h)血清MDA

16、濃度降低，SOD活性升高(P＜0.05)。與Placebo組比較，Dex組術中尿量增多，術后AKI的發(fā)生率明顯較Placebo組低(P＜0.05)。兩組患者術后恢復情況及其他不良事件各指標的比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　第二部分 細胞實驗部分
　　倒置顯微鏡下，C組和Dex組細胞貼壁良好，形態(tài)正常;H/R組活細胞數(shù)減少，細胞呈水泡樣變性;Dex+H/R組細胞狀態(tài)較H/R組明顯改善。與C組比較，H/R組和Dex+

17、H/R組HK-2細胞活力降低，凋亡率升高(P＜0.05);與H/R組比較，Dex+H/R組HK-2細胞活力升高，凋亡率降低，與C組比較，H/R組和Dex+H/R組SOD活性降低，MDA濃度及GRP78、CHOP、caspase-12和活化caspase-3的表達上調(P＜0.05);與H/R組比較，Dex+H/R組SOD活性升高，MDA濃度及GRP78、CHOP、caspase-12和活化caspase-3的表達下調(P＜0.05)。<