七氟醚、異氟醚對骨肉瘤MG63細胞增殖、凋亡及化療敏感性的影響.pdf

1、過去的幾十年中麻醉專業(yè)已經(jīng)把它的臨床實踐從大部分局限在手術(shù)室擴展到包括“急性疼痛治療”、“術(shù)后監(jiān)護治療”、“重癥監(jiān)護治療”、“慢性疼痛治療”、“睡眠治療”和“姑息治療”在內(nèi)的圍術(shù)期醫(yī)療范疇。最近麻醉學雜志上有一篇文章討論將“圍術(shù)期醫(yī)學”加到“麻醉科”的名稱中并決定如何擴展最新的培訓課程[1]?！奥樽砜啤备麨椤奥樽砑皣g(shù)期醫(yī)學科”已達成專家共識。而在中國劉進也提出了“改善圍術(shù)期患者的轉(zhuǎn)歸是麻醉醫(yī)生始終不渝的使命”。麻醉藥物及方法的選擇對

2、患者術(shù)后的轉(zhuǎn)歸有重要影響。腫瘤手術(shù)患者術(shù)中都需要接觸到麻醉藥物。麻醉藥物對腫瘤的生物學特性影響最近越來越受到關(guān)注。最近有研究表明異氟醚可促進卵巢癌的增殖[2]，同時異氟醚還可促進前列腺癌的增殖、遷移及化療耐藥[3]。2013年麻醉學雜志上發(fā)表的異氟醚促進腎細胞癌的增殖及遷移受到了廣泛的關(guān)注及討論[4]。而之前的研究表明常用吸入麻醉藥如氟烷、七氟醚及異氟醚對腫瘤細胞增殖有抑制作用，且與處理時間密切相關(guān)[5]。以上結(jié)論的差異可能是由于吸入麻

3、醉藥處理的時間及與腫瘤細胞種類的不同導致。又有研究顯示七氟醚可拮抗順鉑對艾氏腹水細胞瘤的DNA毒性。骨肉瘤是一種高致殘率的惡性腫瘤。其手術(shù)常用麻醉藥物為七氟醚和異氟醚。而七氟醚、異氟醚對骨肉瘤生物學特性及化療敏感性的影響并未見相關(guān)報道。
　　本課題將應用腫瘤生物學常用實驗技術(shù)及分子生物學常用實驗方法對吸入麻醉藥對骨肉瘤MG63細胞增殖凋亡及對順鉑化療敏感性的影響進行研究，并檢測相關(guān)蛋白分子水平的變化，探討可能的相關(guān)機制。
　

4、　實驗一七氟醚、異氟醚對骨肉瘤MG63細胞增殖、克隆形成及凋亡的影響
　　目的：
　　觀察不同濃度七氟醚、異氟醚對骨肉瘤 MG63細胞增殖、克隆形成能力及凋亡的影響。
　　方法：
　　將MG63細胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，復蘇細胞，常規(guī)培養(yǎng)細胞。實驗分七組：對照組（C組）：充入含5％CO2、21%O2、74%N2混合氣體，處理4 h，七氟醚組（S1組）：1.7%七氟醚的上述混合氣體處理4 h，七氟醚

5、組（S2組）：3.4%七氟醚的混合氣體處理4 h，七氟醚組（S3組）：5.1%七氟醚的混合氣體處理4 h，異氟醚組（I1組）：充入含有1.3%異氟醚的混合氣體處理4 h，異氟醚組（I2組）：2.0%異氟醚混合氣體處理4 h，異氟醚組（I3組）：2.6%異氟醚混合氣體處理4 h。用MTT法檢測各組細胞的增殖抑制率，平板克隆形成實驗檢測各組細胞的克隆形成能力，用流式細胞術(shù)檢測各組細胞的凋亡率。
　　結(jié)果：
　　1．MTT法檢測顯

6、示:與對照組相比，七氟醚、異氟醚處理組增殖抑制率增高（P<0.05），其中 S3組和I3組增殖抑制率高于其它各組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示七氟醚、異氟醚對骨肉瘤MG63細胞增殖有抑制作用，其中高濃度的吸入麻醉藥抑制作用更明顯。
　　2．平板克隆形成實驗：與對照組相比，各濃度七氟醚、異氟醚組克隆形成率要低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但組間比較顯示各濃度七氟醚組和異氟醚組無差異。提示七氟醚、異氟醚對骨

7、肉瘤 MG63細胞克隆形成有抑制作用，但與濃度關(guān)系不大。
　　3．流式細胞術(shù)結(jié)果：與對照組相比，各濃度七氟醚、異氟醚組細胞凋亡率無差異（P>0.05），組間多重比較顯示，各組間細胞凋亡率無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。提示各濃度七氟醚、異氟醚并不促進骨肉瘤MG63細胞的凋亡。
　　結(jié)論：
　　七氟醚、異氟醚對骨肉瘤MG63細胞增殖有抑制作用，高濃度抑制作用更明顯；七氟醚、異氟醚對骨肉瘤MG63細胞克隆形成能力有抑制作用，

8、但與濃度關(guān)系不大；七氟醚、異氟醚對骨肉瘤MG63細胞凋亡無影響，提示七氟醚、異氟醚對MG63細胞增殖抑制作用與凋亡無關(guān)。
　　實驗二七氟醚、異氟醚對順鉑誘導的骨肉瘤MG63細胞凋亡的影響及相關(guān)機制
　　目的：
　　觀察2.5%七氟醚、2.0%異氟醚對順鉑誘導的MG63細胞凋亡率的影響。
　　方法：
　　同實驗一。實驗分為六組：對照組，只充入含5% CO2、21%O2、74%N2混合氣體，處理4 h；七氟醚組

9、，含2.5%七氟醚的混合氣體處理4h；異氟醚組，含2.0%異氟醚的混合氣體處理MG63細胞4h；順鉑組：用終濃度為10mg/L的順鉑處理MG63細胞24h；順鉑+七氟醚組，加入終濃度為10mg/L的順鉑處理24h另于開始4h內(nèi)同時給予2.5%七氟醚處理；順鉑組+異氟醚，加入終濃度為10mg/L的順鉑處理24h另于開始4h內(nèi)同時給予2.0%異氟醚處理。
　　MTT法檢測各組細胞活力，流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率，Western bl

10、ot檢測各組細胞p-Akt、NF-κB P65、Hif-1α、Bcl-2、Bax蛋白表達水平。
　　結(jié)果：
　　1. MTT法結(jié)果：與對照組相比，各組細胞吸光度值降低（P<0.05），其中順鉑組、順鉑+七氟醚組、順鉑+異氟醚吸光度值明顯低于其它各組（P<0.05），提示七氟醚、異氟醚、順鉑對MG63細胞活力有影響，順鉑對其活力影響更明顯；與順鉑組相比，順鉑+七氟醚組、順鉑+異氟醚吸光度值高于單純順鉑組，差異具有統(tǒng)計學意義（P

11、<0.05），提示七氟醚、異氟醚對順鉑對骨肉瘤MG63細胞毒性作用有拮抗作用。
　　2.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，順鉑組、順鉑+七氟醚組、順鉑+異氟醚組細胞凋亡率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示順鉑誘導了骨肉瘤MG63細胞凋亡；與順鉑比相比，順鉑+七氟醚組、順鉑+異氟醚細胞凋亡率降低于（P<0.05），提示七氟醚、異氟醚對順鉑誘導MG63細胞凋亡有拮抗作用。
　　3. Western blot結(jié)

12、果顯示：與順鉑組相比，順鉑+七氟醚組、順鉑+異氟醚組NF-κB P65、Hif-1α、Bcl-2表達升高，Bax表達減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示七氟醚、異氟醚促進了NF-κB的活化，提高了Hif-1α表達水平，并改變了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達，七氟醚、異氟醚對骨肉瘤MG63對順鉑化療敏感性的影響可能與這些蛋白表達變化有關(guān)。p-Akt蛋白表達在各組間并無差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　七氟