Survivin在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)及Survivin反義寡核苷酸(ASODN)對骨肉瘤MG 63細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的作用.pdf

1、伴隨腫瘤分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的進(jìn)步，腫瘤出現(xiàn)的主要因素當(dāng)前指出是常規(guī)的凋亡體制遭受阻止，此外，眾多的妨礙凋亡的因子參加這個活動。IAP家族為現(xiàn)在研究的主要內(nèi)容。一類架構(gòu)有關(guān)的蛋白被凋亡蛋白抑制劑(inhibitorof apoptosis proteins，IAPs)所編碼，這一家族構(gòu)成基本上會借助直觀層面的聯(lián)合與阻止特定的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)來抑制細(xì)胞凋亡，是調(diào)控啟動Caspase和效應(yīng)Caspase的唯

2、一內(nèi)源性蛋白。迄今為止，在人體新發(fā)現(xiàn)的IAPs家族有8個成員，即NAIP、XIAP(ILP-1/MIHA)、cIAP-1(HIAP-2/MIHB)、Survivin(TIAP)、Apollon(Bruce)、cIAP-2(HIAP-1/MI-HC)、ILP-2(Ts-IAP)與Livin(ML-IAP/KIAP)。其中Survivin是近幾年發(fā)現(xiàn)的一個IAPs家族中的成員，因其在正常人體的組織內(nèi)均無明顯表達(dá)，而在惡性腫瘤組織中呈特異性高

3、表達(dá)，故已作為聯(lián)系細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡界面的重要因子，逐漸成為骨肉瘤領(lǐng)域研究的熱點。
　　Survivin基因由Ambrosini等借助效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體1(ECPR1)內(nèi)的cDNA自人類基因庫內(nèi)選取，15kb是基因的所有長度，其位置在17q25染色體上，存在的外顯子數(shù)量是4個，內(nèi)含子的數(shù)量是3個，進(jìn)行一定的編碼活動以后出現(xiàn)Survivin蛋白，存在氨基酸142個，這是當(dāng)前看到的IAP蛋白分子數(shù)量最少的一種，這不僅能夠約束細(xì)胞的凋零

4、，也參加細(xì)胞在有絲、胞質(zhì)等分裂活動與細(xì)胞階段性的控制與變動腫瘤的血管出現(xiàn)：（1）抑制細(xì)胞凋亡作用：①Survivin通過BIR功能區(qū)的抑制凋敝有關(guān)的Trp67、Pro33、Cys84等氨基酸殘基在Caspase-3、Caspase-7方面也會發(fā)生重要的作用，限制其生命力的體現(xiàn)，規(guī)避細(xì)胞持續(xù)的出現(xiàn)凋敝的情況。②survivin-CDK4是Survivin經(jīng)過與CDK4——細(xì)胞周期調(diào)控因子形成混合物質(zhì)，讓這一混合物能夠逸散出P21，將其和C

5、aspase-3聯(lián)系，進(jìn)而從側(cè)面阻止Caspase，防止細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的情況。③近幾年的研究指出，survivin為p34cdc-cyclinB1——周期蛋白激酶進(jìn)行有絲分裂導(dǎo)致的底物，經(jīng)過磷酸化操作，使得survivin Thr34位點會和caspase-9聯(lián)系，阻止其活力，防止Caspase-9依靠細(xì)胞凋亡信息進(jìn)行傳輸。（2）細(xì)胞周期影響：Survivin和CDK4聯(lián)系之后，對抗性的阻止出現(xiàn)混合物CDK4／p16(INK4a)，深層次

6、的讓CDK2/cyclin E進(jìn)行活化操作與Rb出現(xiàn)磷酸化反應(yīng)，進(jìn)而增加G1期朝S期變換的速度。Survivin位于G2/M階段出現(xiàn)的非常規(guī)表現(xiàn)，由于RING鋅指架構(gòu)并不存在于羧基末端，它主要是一個α螺旋架構(gòu)，長度是6.5納米，擁有氨基酸的數(shù)量是40，早期有絲分裂的時候，位于這個結(jié)構(gòu)中，Survivin與有絲分裂紡錘體中的微小血管產(chǎn)生特異的可飽和操作，進(jìn)而能夠阻止由于DNA破壞抑或異常自身形成細(xì)胞凋敝的狀況，而有絲分裂也讓變化細(xì)胞異常增

7、加。
　　阻止細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生命力強化，這是腫瘤細(xì)胞的相同性質(zhì)，因此，損傷腫瘤細(xì)胞采用的放化療運用的重要原理就是細(xì)胞凋敝。因為這能夠阻止腫瘤組織內(nèi)的Survivin蛋白有選擇的出現(xiàn)表達(dá)高的情況，因此，可以給出一定的假定，阻止Survivin可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞自主型凋敝與死亡，而當(dāng)前基于Survivin的靶點探究診療骨肉瘤的方式基本上聚焦在沉默與阻止Survivin表達(dá)與影響層面。相對于RNA干擾技術(shù)來說，反義寡核苷酸技

8、術(shù)具有轉(zhuǎn)染效率高、特異性強、潛在毒性弱、作用時間充分、實驗準(zhǔn)備及操作簡便的優(yōu)點。這項由Zamecnik于1978年首先設(shè)計，并用來阻止Rous肉瘤病毒繁衍的方式，漸漸的變成人們普遍認(rèn)為的實驗科技與診療方式。這一道理是借助異常封閉靶基因的表達(dá)而產(chǎn)生作用的。因為寡核苷酸存在容易消解、細(xì)胞透氣性不高等特征，當(dāng)前基本上會運用硫代修飾來加大其平穩(wěn)性能與借助脂質(zhì)體采用包埋的方式來加大細(xì)胞透氣性，進(jìn)而添加靶細(xì)胞中的合理藥劑水平。Liang等把pEGF

9、P-C1-Survivin這一反義引物在MG63骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，隨后伴隨pEGFP-C1-Survivin增加，在某種程度上就會制約MG63細(xì)胞的增加，削弱Survivin mRNA和蛋白水平，提升caspase-3生命力，骨肉瘤MG63細(xì)胞凋敝比例逐漸加大、遠(yuǎn)期侵入遷移的水平顯著遭受約束。Wu等也運用反義寡核苷酸技術(shù)阻止MG63內(nèi)Survivin表達(dá)，其把反義寡核苷酸借助三類具有差異的濃度，即200、400與600nm對MG

10、63細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，指出MG63細(xì)胞增殖也會遭受約束，凋亡都會出現(xiàn)顯著性的提升。一旦藥劑水平是600nm的時候，MG63細(xì)胞凋亡比重會出現(xiàn)最高值，說明借助反義寡核苷酸技術(shù)診療骨肉瘤的時候存在藥物依靠效應(yīng)，此外，實驗階段，可以看到伴隨反義寡核苷酸水平的提升，F(xiàn)as蛋白表達(dá)逐漸提升，進(jìn)而活化Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋敝死亡體系，因此，這一影響體制或許是mRNA-DNA混合物對核糖核酸酶H進(jìn)行活性操作，進(jìn)而讓mRNA出現(xiàn)分解，混合物mRNA-DNA

11、阻止mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄操作，進(jìn)而阻止蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)操作。而饒耀劍等把survivin反義寡核苷酸與細(xì)胞周期非特異性治療藥劑——多柔比星進(jìn)行協(xié)同應(yīng)用，可以顯著的抑制MG63細(xì)胞的出現(xiàn)，增加治療的敏感性。研究指出，survivin反義寡核苷酸可以增加化療成效，進(jìn)而降低化療藥劑水平水平，降低藥劑出現(xiàn)的不利影響。
　　綜上所述，我們擬通過對Survivin與骨肉瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系的研究，分析治療干預(yù)Survivin后的結(jié)果，評價采用S

12、urvivin反義寡核苷酸(ASODN)治療后骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)的Survivin水平，觀察此種治療手段對骨肉瘤生長的影響，使Survivin反義寡核苷酸(ASODN)成為骨肉瘤靶向治療的新方法。
　　目的:
　　驗證survivin蛋白在骨肉瘤細(xì)胞系MG63上的表達(dá)；制備針對骨肉瘤MG63細(xì)胞系的Survivin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，對比分析轉(zhuǎn)染前后Survivin在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)；研究Survivin反義寡核苷酸在骨肉瘤

13、增加與凋亡方面的影響；探討Survivin反義寡核苷酸對骨肉瘤侵襲能力的影響。
　　方法:
　　以免疫細(xì)胞染色法和western blot方法驗證骨肉瘤細(xì)胞MG-63中Survivin蛋白的表達(dá)；以western blot的方法驗證骨肉瘤細(xì)胞MG-63中Survivin蛋白的表達(dá)。設(shè)計合成特異性靶向Survivin的ASODN對MG-63細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并設(shè)空白及相同濃度的正義(SODN)對照組進(jìn)行比較。再采用Western

14、blot技術(shù)檢測各組MG-63細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Survivin蛋白的表達(dá)；設(shè)計合成特異性靶向Survivin的ASODN,以不同濃度對MG-63細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,并設(shè)空白、正義(SODN)對照組進(jìn)行比較。而用400nM濃度的survivin ASODN轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞48h后，再通過MTT方法檢測骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖情況及流式細(xì)胞儀觀察骨肉瘤細(xì)胞MG-63凋亡情況；設(shè)計合成特異性靶向Survivin的ASODN,以200nM濃度的survi

15、vin ASODN轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞后,設(shè)空白、正義(SODN)對照組進(jìn)行比較。采用Transwell實驗檢測骨肉瘤細(xì)胞MG-63的侵襲能力。
　　結(jié)果:
　　細(xì)胞貼壁24h后，我們用免疫細(xì)胞染色和westernblot的方法對骨肉瘤細(xì)胞MG-63中survivin蛋白進(jìn)行鑒定。免疫細(xì)胞染色結(jié)果顯示survivin蛋白主要表達(dá)于MG-63的細(xì)胞核中，western blot檢測結(jié)果顯示MG-63細(xì)胞裂解液中有特異性的surv

16、ivin蛋白條帶；western blot檢測結(jié)果顯示MG-63細(xì)胞裂解液中有特異性的survivin蛋白條帶。ASODN能降低 MG-63細(xì)胞內(nèi)survivin蛋白的表達(dá)，Survivin反義寡核苷酸（ASODN）轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系MG63后Survivin蛋白表達(dá)均明顯弱于SODN對照組和空白對照組；轉(zhuǎn)染ASODN后的MG-63細(xì)胞增殖較空白對照組及SODN組的細(xì)胞增殖速度顯著減慢（P<0.05），并呈現(xiàn)出濃度及時間依賴性。采用流式細(xì)

17、胞儀檢測發(fā)現(xiàn)Survivin ASODN轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡數(shù)增多，凋亡率均較脂質(zhì)體對照組、正義對照組顯著增加（P<0.001）；轉(zhuǎn)染ASODN后的MG-63細(xì)胞與脂質(zhì)體對照組、正義對照組相比，侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低（P<0.001）。
　　結(jié)論:
　　該部分實驗證實了骨肉瘤細(xì)胞MG-63中有survivin的表達(dá)；靶向Survivin的ASODN可以顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞中Survivin蛋白的表達(dá)，此種轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的制備為進(jìn)一步實驗積