miR-192靶向調(diào)控MMP-11對人骨肉瘤MG63細胞侵襲及遷移的影響.pdf

1、背景和目的：
　　骨肉瘤是一種起源于原始成骨間充質(zhì)細胞的惡性腫瘤，是兒童和青少年最主要的原發(fā)性骨腫瘤。手術和多種藥物化療是本病的標準治療方案，骨肉瘤治療的新進展已經(jīng)使患者的預后得到了顯著改善，但仍有大約40％的患者發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，提示了腫瘤細胞的化療耐藥性。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的生物標志物來預測這些患者的預后，并提供治療方法。微小核糖核酸（miRNA）是小的非編碼單鏈 RNA，長度為19到25個核苷酸，存在于植物和動物的基因組中。m

2、iRNA的正常功能包括調(diào)控細胞分化途徑、細胞周期和細胞凋亡。miRNAs的表達失調(diào)可能導致了腫瘤的發(fā)展。最近，在肺癌、膀胱癌、直腸癌、乳腺癌等癌細胞中，均發(fā)現(xiàn)miR-192表達下調(diào)，且常抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移。但是至今未見 miR-192在骨肉瘤中的表達和對骨肉瘤的影響?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類鋅離子依賴性金屬蛋白酶。MMP-11在胚胎著床，器官發(fā)育，組織退化、修復等過程中起作用，同時還影響許多疾病，如動脈粥樣硬化、類風濕性關

3、節(jié)炎和癌癥。原發(fā)腫瘤中高水平的MMP-11與患者的不良預后密切相關。
　　本實驗旨在研究miR-192靶向調(diào)節(jié)MMP-11蛋白對骨肉瘤侵襲和遷移的影響，了解 miR-192、MMP-11與骨肉瘤之間的關系，從而為骨肉瘤的診斷和基因靶向治療提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.從臨床上收集了20例骨肉瘤患者的骨肉瘤組織及匹配的癌旁組織。對組織中miR-192及MMP-11基因的mRNA表達采用qRT-PCR方法進行檢測。此外，

4、采用Western blot實驗對組織中MMP-11蛋白的表達水平進行檢測。
　　2.用脂質(zhì)體將合成的miR-192 mimics和negative control轉(zhuǎn)入骨肉瘤MG63細胞中。根據(jù)轉(zhuǎn)染物質(zhì)的不同，將細胞分成三組。miR-192組：轉(zhuǎn)染 miR-192 mimics和脂質(zhì)體；NC組：轉(zhuǎn)染miR-192 negative control和脂質(zhì)體；Blank組：僅轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體。轉(zhuǎn)染后的細胞置于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng),用于后續(xù)實驗

5、。
　　3.對三組細胞進行劃痕，觀察miR-192對MG63細胞遷移的影響。
　　4.對三組細胞進行Transwell實驗，觀察miR-192對MG63細胞侵襲的影響。
　　5.對miR-192的作用靶標進行生物信息學預測，將miR-192 mimics或者negative control分別與構建的MMP-11的3‘UTR區(qū)的野生型及突變型重組報告基因載體，共轉(zhuǎn)染入骨肉瘤MG63細胞中，通過Western blot和

6、雙熒光素酶報告實驗證實miR-192的作用靶標。
　　結(jié)果：
　　1.骨肉瘤組織中miR-192的表達水平明顯低于癌旁組織(P<0.05),骨肉瘤組織中MMP-11基因的mRNA和蛋白表達水平明顯高于癌旁組織(P<0.05)。
　　2.三組細胞轉(zhuǎn)染后，miR-192組的miR-192表達水平明顯高于 NC組和Blank組(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功。
　　3.劃痕實驗結(jié)果表明：與NC組和Blank組相比，miR

7、-192組骨肉瘤MG63細胞的遷移能力明顯下降。
　　4. Transwell實驗結(jié)果表明：與NC組和Blank組相比，miR-192組穿過基底膜的骨肉瘤MG63細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。
　　5.生物信息學分析軟件軟件預測miR-192的作用靶標是MMP-11。雙熒光素酶報告實驗和Western blot結(jié)果證明MMP-11是miR-192的作用靶標，miR-192靶向作用于MMP-11的3‘UTR，負調(diào)控其表達。<