MDR1基因與白色念珠菌毒力相關性及藥物聯(lián)用治療感染小鼠的研究.pdf

1、目的:
　　耐藥白色念珠菌的治療一直是臨床關注的問題，耐藥白色念珠菌多藥耐藥基因MDR1的高表達是否引起毒力變化，也是有爭議的話題。利用MDR1基因高表達的耐藥白色念珠菌CaR建立彌散性感染小鼠模型。在此基礎上，利用基因工程改造菌株CaDEL（MDR1基因敲除菌株）、CaCOM-A（MDR1敲入菌株）、CaCOM-B（MDR1敲入菌株）感染小鼠，進行MDR1基因與白色念珠菌毒力相關性研究，探討MDR1高表達是否對毒力有影響。同時，

2、開展抗耐藥真菌藥物的篩選，建立藥物的體內(nèi)篩選系統(tǒng)。
　　方法：
　　將耐藥白色念珠菌CaR尾靜脈接種免疫抑制ICR小鼠，建立彌散性感染小鼠模型，評價感染小鼠的生存狀況和平均生存時間；采集感染小鼠的腎、心、腦、肺、脾、肝組織進行組織載菌量檢測和病理診斷；利用流式微球分析技術（CBA）檢測血液和腎組織的細胞因子IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL12p70、IL-15、IL-17、TN

3、F-α、IFN-γ、GM-CSF的變化；在此基礎上，利用基因工程改造菌株CaDEL、CaCOM-A、CaCOM-B感染小鼠，評價MDR1基因對小鼠毒力的影響，以及檢測感染腎組織白色念珠菌的AFT2、CEK1、CPH1、CPP1、EFG1、FLO86個菌絲相關毒力因子和ALS1、ALS5、HGC1、HWP1、INT1、MNT1、PMT1、PMT6、TCC1、TEC1、TPK2、TUP112個粘附相關毒力因子的變化；并利用建立的耐藥白色念珠

4、菌彌散性感染小鼠模型，口服給予氟康唑、原黃素、聯(lián)合藥物，進行模型應用評價研究。
　　結果：
　　1.建立耐藥白色念珠菌彌散性感染小鼠模型
　　CY免疫抑制ICR小鼠接種1.0×105CFU CaR，14天內(nèi)死亡率約為90％。臨床表現(xiàn)：虛弱，立毛，眼部出現(xiàn)分泌物，打轉，偏頭癥狀、死亡。解剖顯示：腎組織腫大，出現(xiàn)白色斑點，腦組織表面散布出血點。載菌量檢測：腎、心、腦、肺、脾、肝組織都檢出白色念珠菌，腎的載菌量最高，其次是心

5、、腦、肺、脾、肝；隨著感染時間的推移，各組織中的載菌量數(shù)逐漸減少；組織病理診斷：HE染色可見組織炎性細胞浸潤，其中，腎組織可見真菌性肉芽腫病理變化；PAS染色可見白色念珠菌分布在各組織中。細胞因子檢測：感染小鼠顯示急性非特異性炎癥反應。血液中IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-1β與對照組相比出現(xiàn)明顯升高，其它細胞因子未見明顯變化；腎組織細胞因子與對照組相比，IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-15、IL-17、TNF-α、IF

6、N-γ、GM-CSF含量升高，IL-4、IL-10含量降低。
　　2.評價MDR1基因高表達對白色念珠菌毒力的影響
　　與MDR1基因相關的四種白色念珠菌CaR、CaDEL、CaCOM-A、CaCOM-B分別感染免疫抑制的ICR小鼠，均顯示典型的彌散性白色念珠菌感染，感染動物14天內(nèi)死亡率約為90%，四組感染動物之間生存無顯著性差異。感染第6天小鼠相關檢測結果顯示：腎、心、腦、肺、脾、肝組織載菌量無顯著性差異；組織病理診斷也

7、無顯著差異；細胞因子檢測結果顯示CaDEL組與其他組相比，血液中IL-6、IL-10、TNF-α升高，腎組織中IL-1α和TNF-α升高，IL-4、IL-5、IL-6、IL-15、IL-17降低，但是這些差異性并未影響毒力；毒力因子檢測結果顯示，CaR與CaDEL相比，相關毒力因子均表現(xiàn)顯著性差異，然而CaCOM-A、CaCOM-B與CaDEL相比，無顯著性差異。雖然MDR1高表達野生菌株CaR中檢測到12種毒力基因的表達升高，但是通過

8、敲入方式獲得的MDR1基因高表達的CaCOM-A、CaCOM-B菌株未顯示毒力基因表達差異性，因此，單一MDR1基因的高表達不能引起菌株毒力變化。
　　3.評價藥物在耐藥白色念珠菌感染模型上的應用
　　利用耐藥白色念珠菌彌散性感染小鼠模型，開展原黃素、氟康唑及聯(lián)合用藥評價，結果顯示原黃素治療感染小鼠無效，8mg/kg為氟康唑治療感染小鼠的有效劑量，100mg/kg原黃素或2mg/kg氟康唑和16mg/kg原黃素聯(lián)用未見明顯藥

9、效。
　　結論：
　　1.成功建立了耐藥白色念珠菌彌散性感染小鼠模型，并提供了動物生存、組織載菌量、組織病理、細胞因子等指標。
　　2.CaR、CaDEL、CaCOM-A、CaCOM-B感染小鼠相關指標檢測顯示 MDR1基因單一高表達不影響白色念珠菌毒力。
　　3.8mg/kg氟康唑能有效改善耐藥白色念珠菌感染小鼠的生存，100mg/kg原黃素或2mg/kg氟康唑和16mg/kg原黃素聯(lián)用都不能有效改善感染小鼠的