耐藥念珠菌MDR1基因的表達與菌株生長特性和對小鼠毒力的相關性.pdf

1、[目的]
　　許多念珠菌在臨床上成為耐藥念珠菌，這些耐藥念珠菌是否也會改變其毒力，使其成為超級菌危害人類健康是值得關注的重要問題。MDR1基因是與白念珠菌耐藥有關的基因之一，該基因表達量的差異是否會引起菌株生長特性變化和白念珠菌在體內感染毒力的變化尚無報道。為此，我們將利用三株MDR1基因表達量不同的白念珠菌研究該基因的表達量對白色念珠菌生長特性的影響;通過菌體感染免疫抑制小鼠，研究MDR1基因的表達量與耐藥白色念珠菌對小鼠毒力之

2、間的相關性，同時檢測感染小鼠的免疫細胞因子變化，探討白念珠菌的耐藥、毒力和機體免疫之間的關系。為耐藥菌株的致病機理研究、臨床用藥、新藥的研究提供基礎數(shù)據(jù)。
　　[方法]
　　1.耐藥念珠菌MDR1基因的表達與菌株生長特性的相關性
　　分別測定MDR1基因表達量不同的白色念珠菌CaR，CaDel，CaM的體外生長速率、菌絲相細胞形成率和芽管生成情況。
　　2.耐藥念珠菌MDR1基因的表達與其對小鼠毒力的相關性

3、>　　通過腹腔注射環(huán)磷酰胺(CY)使ICR小鼠獲得免疫抑制，尾靜脈接種CaR、CaM、CaDel菌株。觀察感染后14天內各組小鼠的臨床癥狀及生存變化;測定感染后2d、4d、6d、8d、10d各組小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦的載菌量;HE、PAS染色觀察感染后2d、6d、14d各組小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦的病理變化;測定各組小鼠腎臟中IL-1β、TNF-α、IL-12p70、GM-CSF、IL-4、IL-10、IL-6和IFN-γ的水平。

4、
　　[結果]
　　1.耐藥念珠菌MDR1基因的表達與菌株生長特性的相關性
　　體外實驗結果顯示:培養(yǎng)14h后3株菌的生長速率出現(xiàn)差異，表現(xiàn)為CaR＞CaM＞CaDel，培養(yǎng)22h后3株菌逐漸到達生長穩(wěn)定期;體外誘導培養(yǎng)過程中3株菌都不斷長出新芽管，培養(yǎng)4h后3株菌均有90％以上的酵母相轉化為菌絲相，而且CaR與CaM、CaDel有顯著差異(P＜0.01)，CaM與CaDel之間無差異。
　　2.耐藥念珠菌MDR

5、1基因的表達與其對小鼠毒力的相關性
　　(1)感染小鼠死亡率變化。3組小鼠在染菌后均出現(xiàn)臨床癥狀，甚至死亡，而且CaR組的小鼠明顯比其它組表現(xiàn)出更嚴重的臨床癥狀。感染后14天內，CaR組小鼠死亡率達73％，CaM組小鼠未出現(xiàn)死亡，CaDel組小鼠死亡率為12.5％。CaR組小鼠死亡結果與CaM、CaDel組比較均有顯著差異(P＜0.01)，CaM與CaDel組死亡結果比較未見明顯差異。
　　(2)各組織載菌量變化。CaR、C

6、aM、CaDel感染小鼠，在染菌后10天內心、肝、脾、肺、腎、腦各個臟器中均檢測到了菌體，而且各組動物的各組織載菌量大多隨著時間的推移顯示下降趨勢。腦、脾、肝組織感染早期（2天～6天）載菌量出現(xiàn)一過性上升，隨后下降。載菌量從高到低分布:腎＞腦＞心＞肺＞脾＞肝。各感染組的組織載菌量的變化主要顯示在感染的早期，感染第8天后各感染組之間未見明顯差異。感染早期CaR組小鼠的心、脾、肝、肺的載菌量均比CaM、CaDel組高，其中心和脾的載菌量變化

7、出現(xiàn)顯著差異（P＜0.01）;腎和腦組織的載菌量在各感染時間點上各感染組之間未見顯著差異。CaM和CaDel各組織的載菌量在各感染時間點上也未見顯著差異
　　(3)組織病理變化。白色念珠菌感染免疫抑制小鼠顯示彌散性感染特征，心、肝、脾、肺、腎、腦各組織都受到損傷，真菌浸潤。其中腎、腦組織的損傷最為嚴重。組織病理學上主要表現(xiàn)出以酵母型或菌絲型白念珠菌浸潤，伴隨中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等炎細胞浸潤形成彌漫性真菌性膿腫為主的的典型

8、變化。感染第2天，病灶構成以菌絲型和酵母型真菌為主，病灶處組織出現(xiàn)變性、壞死，但未見炎癥細胞浸潤;感染第6天，病灶構成以酵母型真菌為主，菌絲型真菌減少，病灶處組織變性、壞死，病灶周圍可見炎癥細胞浸潤;感染第14天，病灶數(shù)量減少，體積縮小，真菌在臟器中的分布大大減少，而以炎癥細胞浸潤和間質增生病變?yōu)橹?，在臟器中形成肉芽腫或增生病灶。
　　三組相比較，CaR組病灶分布更為廣泛，除腎臟、心臟和腦外，脾臟和肺臟均有不同程度真菌浸潤;并且感

9、染第2天，CaR組心臟的真菌浸潤病灶數(shù)量明顯超過CaM組和CaDel組，病灶內菌體形態(tài)，CaR組主要表現(xiàn)為菌絲型和酵母型真菌為主，CaM和CaDel組以酵母型為主。
　　(4)腎組織細胞因子分泌變化。腎組織細胞因子顯示耐藥念珠菌急性感染過程中，促炎因子大量增生。
　　感染第2天，CaR組腎組織細胞因子IL-12p70、GM-CSF、IL-4、IL-10未見升高，其它細胞因子明顯升高;而CaM組和CaDel組8種被檢因子均明顯

10、升高。而且，CaM組和CaDel組的IL-1β、IL-4、IL-10、TNF-α和、IL-12p70、GM-CSF均明顯高于CaR組，具有顯著性差異(P＜0.01);而CaM組與CaDel組之間比較未見差異;但是，3個感染組的IL-6和IFN-γ量比較未見明顯差異。
　　感染第4天，各組的細胞因子都出現(xiàn)下降。CaM組小鼠腎中IL-1β、IL-4、IL-10、IL-12p70、TNF-α、GM-CSF、IL-6和IFN-γ的含量均高

11、于CaR組和CaDel組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。CaR組與CaDel組之間細胞因子量之間未見明顯差異。
　　感染第6天后，3組小鼠的腎組織細胞因子變化趨于穩(wěn)定，3組比較未見明顯差異。
　　[結論]
　　1.耐藥白色念珠菌MDR1基因表達量的高低，影響了菌株的生長和菌絲形成速度，但并不抑制菌絲的生成。且隨其MDR1表達量升高菌株的生長速率加快，菌絲相轉變加快，芽管的生成速度增加。
　　2.耐藥白色念珠菌M

12、DR1基因表達量的高低，影響了菌株對小鼠的毒力。CaR、CaM、CaDel都能損傷小鼠的組織器官，引起小鼠發(fā)病甚至死亡。MDR1基因表達量高的菌株CaR對小鼠的毒力增強，死亡率增高;MDR1基因低表達量的CaM、CaDel菌株對小鼠的毒力減弱，死亡率降低，與CaR相比較具有顯著性差異。結合組織載菌量檢測，CaR組心、脾的載菌量增加，與CaM、CaDel組比較，具有顯著差異。然而，念珠菌感染嚴重的腎、腦，載菌量絕對數(shù)量較高，各組之間卻沒有

13、明顯差異，感染小鼠的死亡與心、脾的載菌量變化密切相關，與腎、腦的相關性不大。組織病理診斷上也顯示，感染早期，CaR菌株對心組織損傷程度較大，病灶中顯示菌絲型菌與酵母型菌共存，然而，CaM、CaDel的病灶主要以酵母型菌為主。病灶中菌絲體的增多，體現(xiàn)了念珠菌對小鼠毒力的增強。
　　3.耐藥白色念珠菌MDR1基因表達量的高低，影響了小鼠感染后細胞因子水平。3株菌CaR、CaM、CaDel感染小鼠細胞因子的變化主要顯示在感染的第2天，C

14、aR的IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-6上升，其他因子IL-12p70、GM-CSF、IL-4和IL-10下降，而CaM和CaDel組的細胞因子水平均顯示顯著上升;感染第4天后逐漸下降;感染第6天后恢復到穩(wěn)定狀態(tài)。結合感染的死亡率，感染第2天，MDR1基因高表達的CaR組，促炎因子IL-1β和TNF-α上升程度明顯比CaM和CaDel組低;而且促炎因子IL-12p70和GM-CSF的分泌受到抑制，不能有效發(fā)揮早期抗感染作用;以