藍(lán)芪復(fù)方中多糖的純化及分子量測定.pdf

1、目的：對藍(lán)芪復(fù)方中板藍(lán)根、黃芪、淫羊藿多糖進(jìn)行分離純化并測定其分子量，為后續(xù)藍(lán)芪復(fù)方多糖注射劑的制備及免疫活性研究提供實驗及物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　方法與結(jié)果：在單因素研究的基礎(chǔ)上以多糖得率為指標(biāo)采用正交設(shè)計試驗，優(yōu)化了板藍(lán)根、黃芪、淫羊藿三味藥材中多糖提取的最佳工藝。板藍(lán)根：稱取適量脫脂板藍(lán)根藥材，15倍量蒸餾水浸泡30min、90℃溫浸提取2次，每次3 h，合并提取液，濃縮至1倍藥材量，5000rpm離心10 min，上清液加入乙醇，

2、使醇沉濃度75％，靜置12h，濾過得到醇沉物，加入20倍量蒸餾水復(fù)溶醇沉物，得板藍(lán)根多糖液，板藍(lán)根多糖的提取率為2.34%。篩選最佳脫蛋白方法，采用Sevag法除去板藍(lán)根多糖液中的蛋白；在單因素研究基礎(chǔ)上以脫色率為指標(biāo)采用正交設(shè)計試驗篩選D152型大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附最佳脫色工藝為：D152型大孔弱酸陽離子交換樹脂，吸附時間180min、上樣量為1倍柱體積，洗脫流速控制在2mL/min，過濾，收集濾液，測定多糖保留率、蛋白質(zhì)脫除率和脫色

3、率分別為93.91%、77.19%、61.51%；采用截留分子量為3000的透析袋，透析48h進(jìn)一步除去板藍(lán)根多糖液中的小分子色素及無機(jī)鹽；脫色脫蛋白去離子處理的板藍(lán)根多糖液上DEAE-Sephadex A-50凝膠層析柱，分別以不同濃度的鹽進(jìn)行洗脫后得到板藍(lán)根多糖洗脫流份 A、B、C、D、E五個組分，分別上凝膠柱Sephadex G100進(jìn)一步分離純化；通過紫外法測定各組分多糖液在260nm及280nm處無吸收峰，說明不含蛋白和核酸；

4、采用高效液相色譜法測定五組分板藍(lán)根多糖洗脫流份的分子量，色譜條件為Shodex OHpak SB-804 HQ8.0mm×300mm凝膠色譜柱，以100%液相超純水為流動相；380-ELSD型蒸發(fā)光散射檢測器檢測，測得標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子量的線性關(guān)系為lgMr=-1.976RT+19.88，（R2=0.9941），Mr線性范圍2.0E+04～5.0E+05，板藍(lán)根多糖洗脫流份A含3種分子量分別為3.2E+05、1.9E+05、1.1E+05，

5、洗脫流份B含2種分子量分別為2.8E+05、1.8E+05，洗脫流份C含3種分子量分別為3.1E+05、1.7E+05、3.9E+04，洗脫流份D含1種分子量為9.5E+03，洗脫流份E含1種分子量為1.3E+03。
　　黃芪：稱取脫脂黃芪適量，加入8倍量蒸餾水浸泡30 min，90℃溫浸提取3次，每次1h，合并提取液，減壓濃縮至5倍藥材量，5000 rpm離心10 min，取上清，加入乙醇，使乙醇濃度為70%，靜置12 h，濾過

6、得到醇沉物，加入20倍量蒸餾水復(fù)溶醇沉物，得黃芪多糖液，黃芪多糖的提取率為2.97%。采用Sevag法除去黃芪多糖液中的蛋白；在單因素研究基礎(chǔ)上以脫色率為指標(biāo)采用正交設(shè)計試驗篩選D152型大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附最佳脫色工藝為：D152型大孔樹脂進(jìn)行動態(tài)吸附，吸附時間180min、黃芪多糖供試液上樣濃度為0.08g/mL、上樣量為1倍柱體積，流速控制在1mL/min，過濾，收集濾液，測定多糖保留率、蛋白質(zhì)脫除率和脫色率分別為96.94%、6

7、2.67%、54.96%。采用截留分子量為7000的透析袋，透析24h進(jìn)一步除去黃芪多糖液中的小分子色素及無機(jī)鹽；脫色脫蛋白去離子處理的黃芪多糖液上DEAE-Sephadex A-50凝膠層析柱，分別以不同濃度的鹽進(jìn)行洗脫后得到黃芪多糖洗脫流份A、B兩個組分，分別上凝膠Sephadex G100進(jìn)一步分離純化得三個洗脫流份A1、A2和B；通過紫外法測定各組分多糖液在260nm及280nm處無吸收峰，說明不含蛋白和核酸；黃芪多糖樣品液的平

8、均分子量測定條件同板藍(lán)根多糖樣品液，檢測結(jié)果：黃芪多糖洗脫流份A1含1種分子量為1.2E+04，洗脫流份 A2含2種分子量分別為1.6E+05、7.5E+04，洗脫流份B含1種分子量為3.4E+04。
　　淫羊藿：稱取脫脂淫羊藿適量，加入20倍量蒸餾水浸泡30 min，90℃溫浸提取2次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮至1倍藥材量，5000 rpm離心10 min，取上清，加入乙醇，使乙醇濃度為70%，靜置12 h，濾過得到醇沉

9、物，加入20倍量蒸餾水復(fù)溶醇沉物，得淫羊藿多糖液，淫羊藿多糖的提取率為2.04%。采用Sevag法除去淫羊藿多糖液中的蛋白；在單因素研究基礎(chǔ)上以脫色率為指標(biāo)采用正交設(shè)計試驗篩選ADS-7大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附最佳脫色工藝為：ADS-7大孔樹脂進(jìn)行動態(tài)吸附，吸附時間180min、淫羊藿多糖供試液上樣濃度為0.33g/mL、上樣量為1.5倍柱體積，流速控制在1mL/min，過濾，收集濾液，測定多糖保留率、蛋白質(zhì)脫除率和脫色率分別為88.42%

10、、54.07%、63.59%。采用截留分子量為3000的透析袋，透析24h進(jìn)一步除去淫羊藿多糖液中的小分子色素及無機(jī)鹽；脫色脫蛋白去離子處理的淫羊藿多糖液上DEAE-Sephadex A-50凝膠層析柱，分別以不同濃度的鹽進(jìn)行洗脫后得到淫羊藿多糖洗脫流份A、B、C三個組分，分別上凝膠Sephadex G100進(jìn)一步分離純化得三個組分段多糖樣品液；通過紫外法測定各組分多糖液在260nm及280nm處無吸收峰，說明不含蛋白和核酸；淫羊藿多糖