腦膜癌病小鼠模型的建立.pdf

1、目的：
　　腦膜癌?。↙eptomeningeal carcinomatosis，LC）是原發(fā)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，局灶或彌漫浸潤(rùn)軟腦膜及蛛網(wǎng)膜下腔，并播散至腦脊液，是惡性腫瘤中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的一種較少見(jiàn)類型，原發(fā)病灶常為肺癌，腺癌是常見(jiàn)的組織學(xué)類型。近年來(lái)，腦膜癌病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，而目前該病的治療效果尚不理想，尚缺乏針對(duì)原發(fā)腫瘤不同來(lái)源及病理特征的有效治療手段。為進(jìn)一步探索相關(guān)治療靶點(diǎn)，以及評(píng)估相關(guān)治療藥物及方法的有效性及安全性，首

2、先需要建立穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。目前腦膜癌病動(dòng)物模型的研究報(bào)道較少，國(guó)外研究者較早通過(guò)小腦延髓池（Cisterna magna，CM）穿刺進(jìn)行的腦膜癌病大鼠模型的實(shí)驗(yàn)性研究及鞘內(nèi)給藥方式需要較復(fù)雜的操作過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)早期腦膜癌病動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行改進(jìn)，旨在建立操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性較好的腦膜癌病小鼠模型，并進(jìn)一步探討模型小鼠腦膜腫瘤中血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion mole

3、cule-1，CD31）的表達(dá)情況。
　　方法：
　　1小鼠小腦延髓池注射法
　　雌性6-8周齡C57BL/6小鼠35只，其中20只隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只，分別經(jīng)小腦延髓池穿刺注射PBS或Lewis肺癌細(xì)胞（Lewis Lung carcinoma cell，LLC）懸液（1.5×105個(gè)細(xì)胞）7.5μl，觀察評(píng)估小腦延髓池注射后兩組小鼠體重隨時(shí)間變化及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀表現(xiàn)；15只隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=3）、

4、PBS組（n=6）和模型組（n=6），當(dāng)小鼠癥狀表現(xiàn)明顯時(shí)，4％多聚甲醛灌流固定取材，小鼠腦和脊髓組織用于組織病理學(xué)蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）及免疫組化分析。
　　2石蠟切片HE染色法
　　4%多聚甲醛固定后的小鼠腦和脊髓組織標(biāo)本經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后制成蠟塊，用Leica RM2235石蠟切片機(jī)切片，切片厚度為5μm。切片經(jīng)脫蠟后進(jìn)行常規(guī)HE染色，組織病理學(xué)觀察軟腦（

5、脊）膜病理改變。
　　3免疫組織化學(xué)法
　　采用免疫組化方法對(duì)模型組及PBS組小鼠橋腦部位的軟腦膜進(jìn)行 CD31染色分析，評(píng)估腦膜癌病血管生成。
　　結(jié)果：
　　1小鼠經(jīng)小腦延髓池緩慢注射10μl稀釋的墨汁溶液后，解剖小鼠腦及脊髓，可見(jiàn)墨汁溶液主要分布于小腦延髓池、腹側(cè)腦池。
　　2小腦延髓池注射LLC細(xì)胞或PBS后兩組小鼠行為學(xué)觀察
　?。?）小腦延髓池注射前對(duì)照組小鼠體重為（18.68±1.08）

6、g，實(shí)驗(yàn)組小鼠體重為（19.43±0.86）g，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.101）。小腦延髓池注射PBS或LLC細(xì)胞懸液后第1天，兩組小鼠體重均下降明顯，對(duì)照組小鼠體重為（17.02±1.63）g，實(shí)驗(yàn)組小鼠體重為（17.08±1.06）g，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.921）。第2~3天，兩組小鼠體重水平仍較低，較前變化不大。第4~10天，兩組小鼠體重均緩慢回升，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。第11天開(kāi)始，對(duì)照組小鼠

7、體重仍在逐漸增加，而實(shí)驗(yàn)組小鼠體重開(kāi)始進(jìn)行性下降直至死亡，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.029）。實(shí)驗(yàn)組小鼠均在40天內(nèi)死亡，中位生存時(shí)間為32.5天，而對(duì)照組小鼠均至觀察終點(diǎn)40天仍存活，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.0001）。
　　（2）實(shí)驗(yàn)組小鼠小腦延髓池注射LLC細(xì)胞后癥狀出現(xiàn)在第10~16天，平均為（13±2）天。全部實(shí)驗(yàn)組（n=10）小鼠均表現(xiàn)為活動(dòng)明顯減少，全身狀態(tài)差（10/10）；其中6只小鼠病程中出現(xiàn)了弓背姿

8、勢(shì)（6/10）；5只小鼠出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)（5/10）；2只小鼠出現(xiàn)拎起尾巴旋轉(zhuǎn)的表現(xiàn)（2/10）。而對(duì)照組小鼠均活動(dòng)正常，未出現(xiàn)上述異常表現(xiàn)。
　　3蘇木精-伊紅染色顯示模型組小鼠癥狀表現(xiàn)明顯時(shí)其腦與脊髓軟膜組織病理可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，以腦基底部及脊髓頸段多見(jiàn)。
　　4免疫組化結(jié)果顯示CD31在模型組及PBS組小鼠橋腦部位軟腦膜的表達(dá)明顯不同，實(shí)驗(yàn)組血管計(jì)數(shù)約為（12.83±3.01）mm-1，對(duì)照組為（6.08±1.02）mm-

9、1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021）。
　　結(jié)論：
　　1通過(guò)小腦延髓池注射Lewis肺癌細(xì)胞可成功建立肺癌腦膜癌病小鼠模型，實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性較好。
　　2腦膜癌病模型小鼠病程中可出現(xiàn)體重進(jìn)行性下降、活動(dòng)明顯較少、全身狀態(tài)差、弓背姿勢(shì)、步態(tài)不穩(wěn)、拎起尾巴時(shí)旋轉(zhuǎn)等異常癥狀表現(xiàn)，但各小鼠表現(xiàn)不盡相同。
　　3腦膜癌病模型小鼠的軟腦膜部位CD31的表達(dá)明顯增多，表明腦膜血管密度增多，提示新生微血管形成可能在腦膜