神經(jīng)粘附因子NLG-1調(diào)控氧化石墨烯毒效應(yīng)分子機制研究.pdf

1、目的:
　　秀麗線蟲是十分經(jīng)典的模式動物，自上個世紀開始就被廣泛應(yīng)用于生命科學研究領(lǐng)域，相關(guān)的研究策略、工具及數(shù)據(jù)十分齊全。作為最簡單的模式動物，它有許多其他模式動物所沒有的優(yōu)點，如培養(yǎng)條件極簡單、生活周期短、通體透明、體細胞數(shù)目固定甚至每個細胞都可以追溯其發(fā)生的源頭。圍繞秀麗線蟲中僅有的Neuroligin:NLG-1的研究有助于我們理解Neuroligins和它的生物學功能。作為神經(jīng)元突觸上的重要組織分子，它與多種神經(jīng)精神疾病

2、相關(guān)。氧化石墨烯(GO)是石墨烯的一種衍生納米材料，由于其特殊而優(yōu)異的理化性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于包括藥物載體、生物傳感器、生物成像等許多研究與應(yīng)用領(lǐng)域。有一定的體外及在體證據(jù)證明GO對生物體具有潛在毒性，然而其致毒的神經(jīng)調(diào)控機制尚不十分明確。本研究以秀麗線蟲NLG-1調(diào)控GO毒效應(yīng)為切入點，探究GO毒效應(yīng)的神經(jīng)調(diào)控機制，同時為工程納米材料在生物醫(yī)學上使用時面對特殊人群需要考慮的問題提供相應(yīng)依據(jù)。
　　方法:
　　對功能缺失突變體

3、、RNA干擾敲降的秀麗線蟲進行GO暴露并選取ROS水平、運動行為能力等毒性評價終點來判斷特定基因是否參與了GO毒效應(yīng)。利用遺傳學手段進行秀麗線蟲基因過表達、恢復(fù)表達，或突變、敲降與過表達、恢復(fù)表達的組合方式進行GO毒效應(yīng)評價來尋找參與GO毒效應(yīng)調(diào)控的神經(jīng)元，以及探索相關(guān)基因在GO毒效應(yīng)調(diào)控時的上下游靶向關(guān)系。以qRT-PCR、GFP熒光分析、生物信息學分析、免疫共沉淀、免疫印跡等手段進一步確認相關(guān)分子機制。用分子探針RhoB探索GO在體

4、轉(zhuǎn)運分布情況。建立行為學模型，探索秀麗線蟲對工程納米材料感知及回避行為。
　　結(jié)果:
　　1.秀麗線蟲中間神經(jīng)元NLG-1調(diào)控氧化石墨毒烯效應(yīng)分子機制
　　利用秀麗線蟲這一在體系統(tǒng)，證明了氧化石墨烯會導致NLG-1/Neuroligin介導的分子信號功能異常。GO暴露會導致突觸后膜神經(jīng)黏附因子Neuroligin表達量的下降。nlg-1功能缺失型突變會造成秀麗線蟲對于GO毒性更加敏感。突變體NLG-1恢復(fù)表達實驗證明，

5、AIY中間神經(jīng)元的NLG-1可以參與GO毒效應(yīng)調(diào)控。秀麗線蟲的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶C，PKC-1是AIY中間神經(jīng)元中NLG-1調(diào)控GO毒效應(yīng)的下游靶點。進一步的實驗證明，秀麗線蟲ERK信號通路中編碼Rap蛋白的基因LIN-45是PKC-1的下游靶點參與了GO毒效應(yīng)調(diào)控。因此，GO暴露會導致中間神經(jīng)元中NLG-1介導的分子信號NLG-1-PKC-1-LIN-45功能失調(diào)，而這一信號在秀麗線蟲響應(yīng)GO暴露過程中可能發(fā)揮重要功能。此外，

6、腸道RNAi敲降編碼FOXO轉(zhuǎn)錄因子daf-16基因能夠抑制過表達NLG-1秀麗線蟲對于GO毒性的抗性，暗示了秀麗線蟲神經(jīng)元中NLG-1信號通路與腸道胰島素信號通路之間的重要關(guān)聯(lián)。
　　2.神經(jīng)元中突觸后膜復(fù)合物分子DLG-1及MAGI-1作為NLG-1的直接靶點參與了GO毒效應(yīng)調(diào)控:
　　利用特異性啟動子Punc-14或Pmyo-3分別恢復(fù)表達神經(jīng)元或肌肉中的NLG-1于nlg-1突變體，發(fā)現(xiàn)NLG-1僅在神經(jīng)元中發(fā)揮調(diào)控

7、GO毒效應(yīng)的功能。利用生物信息學手段找到秀麗線蟲dlg-1、lin-2、magi-1、nmr-1、nmr-2為哺乳動物突觸后膜復(fù)合物的同源基因，對相關(guān)突變體或敲降秀麗線蟲進行GO毒性應(yīng)評價。結(jié)果顯示，只有dlg-1RNAi及magi-1突變體對GO毒性更加敏感。dlg-1RNAi或magi-1突變均可以導致神經(jīng)元過表達NLG-1秀麗線蟲對GO毒性抗性表型的消失。經(jīng)過分析預(yù)測DLG-1及MAGI-1潛在的與NLG-1直接結(jié)合的蛋白結(jié)構(gòu)域位

8、點，通過原核表達相關(guān)結(jié)構(gòu)域，并在NLG-1-C端融合GST標簽、靶蛋白結(jié)構(gòu)域融合6×His標簽的方式進行免疫共沉淀分析，確認了NLG-1-C端可以結(jié)合DLG-1-PDZ-3、MAGI-1-WW(1-2)、MAGI-1-PDZ-3。在共沉淀條件中加入暴露濃度GO，則會直接影響NLG-1-C與DLG-1-PDZ-3、MAGI-1-WW(1-2)、MAGI-1-PDZ-3的結(jié)合效率。
　　3.篩選GO感知與毒效應(yīng)調(diào)控的神經(jīng)元:
　

9、　基于建立的行為學模型，發(fā)現(xiàn)野生型秀麗線蟲會對GO產(chǎn)生回避的行為。NLG-1的兩種突變體(nlg-1(ok259)及nlg-1(tm474))存在GO回避行為缺陷。在突變體的AIY或AIB神經(jīng)元中恢復(fù)表達NLG-1能夠恢復(fù)nlg-1(ok259)突變體GO回避行為缺陷，暗示AIY與AIB中間神經(jīng)元可能參與了秀麗線蟲回避GO行為的調(diào)控。
　　結(jié)論:
　　神經(jīng)粘附因子NLG-1在GO毒效應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮了重要的功能。秀麗線蟲AIY中