稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料用于近紅外光激發(fā)的光動力治療聯(lián)合腫瘤基因治療的研究.pdf

1、第一部分用于光動力治療的稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的制備及應(yīng)用初步探究
　　目的:探討稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料（UCNP）經(jīng)聚乙二醇、聚乙烯亞胺通過層層組裝的方法修飾后并連接上光敏劑二氫卟吩 e6(Ce6)形成的多功能復(fù)合納米材料UCNP-PEG@2×PEI-Ce6用于近紅外光激發(fā)的光動力治療應(yīng)用的可行性及價(jià)值。
　　方法:
　　1)采用高溫?zé)岱纸夥ㄖ苽涑鰮诫sGd3+的上轉(zhuǎn)換納米顆粒NaGdF4(Gd: Yb: Er=78％

2、:20%:2%)，首先利用聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)高分子聚合物修飾納米粒子增加其水溶性，再通過層層組裝的方式將納米粒子表面修飾兩層聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI)層，最后得到帶有足夠正電荷并且仍然具有良好生物相容性的UCNP-PEG@2×PEI復(fù)合納米材料，并對其形貌、電位進(jìn)行表征研究。
　　2)將光敏劑二氫卟吩 e6(Ce6)分子通過疏水作用力裝載 UCNP-PEG@2

3、×PEI，形成 UCNP-PEG@2×PEI-Ce6復(fù)合物，計(jì)算Ce6裝載效率及釋放率，并對復(fù)合物熒光性質(zhì)進(jìn)行表征，檢測復(fù)合物單線態(tài)氧的產(chǎn)生。
　　3)將不同濃度梯度的UCNP-PEG@2×PEI-Ce6進(jìn)行磁共振T1序列的掃描，檢測其磁共振成像性質(zhì)。
　　4)通過體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)（MTT）對UCNP-PEG@2×PEI-Ce6顆粒的體外毒性進(jìn)行研究。
　　5)將不同濃度梯度的UCNP-PEG@2× PEI-Ce6轉(zhuǎn)染

4、人宮頸癌（HeLa）細(xì)胞4小時(shí)后，近紅外光(980nm)照射20分鐘后，測定細(xì)胞存活率。
　　結(jié)果:
　　1)透射電子顯微鏡（TEM）顯示，熒光上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNP）是水溶性良好的單分散納米晶體，平均直徑約在30nm。經(jīng)過層層修飾以后，UCNP-PEG@2×PEI顆粒在水溶液中仍然具有較好的穩(wěn)定性；修飾第二層聚乙烯亞胺之后的UCNP-PEG@2×PEI納米顆粒較修飾第一層聚乙烯亞胺（PEI）之后帶有更多的正電荷；

5、　　2)當(dāng)UCNP與 Ce6的質(zhì)量比為2:1時(shí)，Ce6裝載率可達(dá)10%-11%，再增加裝載量會導(dǎo)致UCNP-PEG@2×PEI-Ce6穩(wěn)定性的下降。
　　3)上轉(zhuǎn)換發(fā)光熒光強(qiáng)度顯示修飾兩層PEI之后的納米顆粒仍然顯示出較高的上轉(zhuǎn)換熒光強(qiáng)度。然而，在UCNP-PEG@2×PEI裝載光敏劑Ce6之后，上轉(zhuǎn)換熒光強(qiáng)度明顯下降，尤其在與Ce6吸收峰重疊的660nm發(fā)射峰處。
　　4)在980nm激光的照射下，隨著時(shí)間的延長，UCNP

6、-PEG@2×PEI-Ce6產(chǎn)生的單線態(tài)氧逐步增加，而游離的Ce6分子則不能產(chǎn)生單線態(tài)氧。
　　5)磁共振T1WI成像結(jié)果顯示在一定的濃度梯度內(nèi)，隨著材料濃度的增加，UCNP-PEG@2×PEI-Ce6磁共振信號逐漸增加。
　　6)體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示UCNP-PEG@2×PEI-Ce6在較高濃度時(shí)對細(xì)胞亦未見明顯毒性作用。7)在980nm激光照射下，UCNP-PEG@2×PEI-Ce6隨著濃度的升高，在細(xì)胞水平顯示出良

7、好的光動力治療效果。
　　結(jié)論:修飾了兩層PEI后的稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料帶有較多正電荷，且生物相容性及上轉(zhuǎn)換熒光強(qiáng)度仍然較高。UCNP-PEG@2×PEI可以通過疏水作用裝載光敏劑Ce6。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UCNP-PEG@2×PEI-Ce6復(fù)合物沒有明顯的生物毒性，同時(shí)具有較好的磁共振成像能力。近紅外光照射下，UCNP-PEG@2×PEI-Ce6獨(dú)特的上轉(zhuǎn)換光致發(fā)光的性能可以激發(fā)Ce6產(chǎn)生單線態(tài)氧，實(shí)現(xiàn)近紅外激發(fā)下的光動力

8、治療，大大提高了治療的穿透深度。因此，UCNP-PEG@2×PEI-Ce6可以作為一種新興的納米載體，用于腫瘤診斷與治療。
　　第二部分稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料用于基因轉(zhuǎn)染及近紅外光激發(fā)的光動力治療聯(lián)合基因治療的研究
　　目的:稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料作為新式納米基因載體用于基因治療以及近紅外光激發(fā)下的光動力治療聯(lián)合基因治療的研究。
　　方法:
　　1）用凝膠阻滯電泳實(shí)驗(yàn)測定 UCNP-PEG@2×PEI-Ce6復(fù)合

9、物和小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）的結(jié)合能力大小。將不同N/P比例(5，10，15，20)對應(yīng)下的不同濃度的UCNP-PEG@2×PEI-Ce6水溶液和1?g siRNA混合，在室溫下將二者孵育20分鐘后進(jìn)行0.8%凝膠阻滯電泳。
　　2）體外無血清及血清存在兩種條件下，按照不同的N/P比例，將UCNP-PEG@2×PEI-Ce6與Plk1 siRNA(siPlk1)孵育20分鐘后轉(zhuǎn)染人宮

10、頸癌細(xì)胞（HeLa）。
　　3）共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞攝取UCNP-PEG@2×PEI-Ce6/FAM-siRNA復(fù)合物的情況以及血清存在情況下對FAM-siRNA轉(zhuǎn)染的影響。
　　4）通過Western blotting以及RT-qPCR實(shí)驗(yàn)研究不同N/P比例及血清存在與否情況下 UCNP介導(dǎo)的siPlk1轉(zhuǎn)染對 HeLa細(xì)胞對應(yīng)的蛋白及mRNA表達(dá)水平的影響。
　　5）兩組經(jīng)轉(zhuǎn)染UCNP-PEG@2×PEI-Ce6/

11、siRNA的細(xì)胞，其中一組進(jìn)行980nm激光照射，另一組不照光作為對照試驗(yàn)，Western blotting實(shí)驗(yàn)研究siRNA的干擾作用是否受到光動力治療過程中產(chǎn)生的單線態(tài)氧的影響。
　　6）體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)（MTT）以及熒光顯微鏡觀察calcein-AM&PI雙染活死細(xì)胞對基因治療、光動力治療以及二者聯(lián)合治療后細(xì)胞生存情況進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1)當(dāng)N/P比在10以上時(shí)，凝膠電泳結(jié)果可見UCNP-PEG@2×P

12、EI-Ce6可以明顯阻滯siRNA。
　　2）共聚焦顯微鏡顯示UCNP-PEG@2×PEI-Ce6-siRNA成功轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞，并且在有血清存在的條件下，UCNP-PEG@2×PEI-Ce6-siRNA轉(zhuǎn)染效率更高。
　　3）Western blotting以及RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明在有血清存在的條件下，siPlk1對HeLa細(xì)胞蛋白表達(dá)的沉默作用更大。
　　4）Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

13、光動力治療過程中產(chǎn)生的單線態(tài)氧不會影響 siRNA誘導(dǎo)的基因沉默，為光動力與基因聯(lián)合治療奠定基礎(chǔ)。
　　5）聯(lián)合治療作用下 HeLa細(xì)胞生存率明顯低于單獨(dú)光動力治療或者基因治療的作用。
　　結(jié)論:在組織穿透能力強(qiáng)的近紅外光激發(fā)下，通過能量共振轉(zhuǎn)移的方式，稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的發(fā)射光可以作為激發(fā)光源激活周圍的光敏劑分子，光敏劑分子產(chǎn)生單線態(tài)氧殺死異常增殖的癌細(xì)胞，從而達(dá)到治療的效果。經(jīng)近紅外光激發(fā)的光動力治療能克服傳統(tǒng)光動力