硫化氫抗l-NAME所致大鼠肝臟損傷作用及機(jī)制的研究.pdf

1、研究H2S對于肝臟的作用，應(yīng)用L-NAME導(dǎo)致的高血壓大鼠模型除了表現(xiàn)為血壓升高外還伴隨著血清脂質(zhì)和脂蛋白的異常。如能探明在肝臟中H2S與NO的關(guān)系以及內(nèi)源性H2S水平與心血管疾病危險(xiǎn)因素的關(guān)系，則可對心血管疾病的防治提供新的思路。
　　本文主要分三部分展開研究：
　　第一部分 硫化氫抗L-NAME所致的大鼠肝臟損傷和心血管風(fēng)險(xiǎn)
　　目的:通過復(fù)制亞硝基左旋精氨酸(NG-nitro-L-arginine methyle

2、ster，L-NAME)誘導(dǎo)的大鼠模型并外源性給予H2S的供體硫氫化鈉(NaHS，sodium hydrosulfide)和格列苯脲（glibenclamide，Gli，KATP通道阻斷劑），以研究H2S對L-NAME所致的大鼠肝損傷的保護(hù)作用和心血管風(fēng)險(xiǎn)。
　　方法:健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只，動物隨機(jī)分為6組，分別為:對照（con組），L-NAME組，con+格列苯脲組（con+Gli組），con+硫氫化鈉

3、組（con+NaHS組），L-NAME+NaHS組，L-NAME+NaHS+Gli組，每組各6只。硫氫化鈉組大鼠采用硫氫化鈉（56μmol/kg）每日腹腔射;其余組大鼠每日腹腔注射相應(yīng)劑量的生理鹽水。L-NAME組大鼠給予配制好的L-NAME水溶液每日日常飲用。格列苯脲組大鼠給予配制好的格列苯脲水溶液每日日常飲用。各組大鼠每周測量尾動脈收縮壓。大鼠給予處理5周后，留取血清和肝臟組織測量血清甘油三脂(TG，triglycerides)，高

4、密度脂蛋白(HDE，high-density lipoprotein)，低密度脂蛋白(LDL，low-density lipoprotein)，總膽固醇(CHO total cholesterol)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT，glutamic-pyruvic transaminase);通過顯微鏡觀察肝組織細(xì)胞排列，組織學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定程度，門管區(qū)結(jié)構(gòu)，脂肪空泡出現(xiàn)和淋巴細(xì)胞浸潤等。
　　結(jié)果:1.與con組大鼠相比，各組大鼠的食物攝入量和水

5、的攝入量和體重隨實(shí)驗(yàn)周數(shù)逐漸增加，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組大鼠均未出現(xiàn)嚴(yán)重疾病、死亡的情況。
　　2.在給予處理前各組的尾動脈收縮壓無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在給予處理后，L-NAME組大鼠的尾動脈收縮壓逐漸升高，L-NAME+NaHS組血壓較L-NAME組顯著降低。L-NAME+NaHS+Gli組血壓較L-NAME+NaHS組血壓升高，與L-NAME組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.血清CHO和ALT各組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。con組，c

6、on+NaHS組，con+Gli組的LDL和TG含量各組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。L-NAME組LDL和TG較con組明顯升高，L-NAME+NaHS組，L-NAME+NaHS+Gli組的LDL和TG較L-NAME組比明顯降低，但兩組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。con組，con+NaHS組，con+Gli組的HDL含量各組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。L-NAME組HDL較con組明顯降低。L-NAME+NaHS組,L-NAME+NaHS+Gli組的HDL較L

7、-NAME組比明顯升高，但兩組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.肝臟組織HE染色后鏡下可見con組，con+NaHS組，con+Gli組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀整齊排列。L-NAME組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，纖維結(jié)締組織增生，部分肝細(xì)胞體積增大、胞漿內(nèi)可見大小不等圓形空泡，部分肝細(xì)胞可見氣球樣變;中央靜脈周圍及匯管區(qū)可見炎性細(xì)胞浸潤。L-NAME+NaHS組和L-NAME+NaHS+Gli組的肝臟組織病理學(xué)變

8、化介于con組和L-NAME組之間。
　　結(jié)論:本研究證實(shí)應(yīng)用NO合酶抑制劑L-NAME造成大鼠血壓的升高、肝臟的損傷和血清肝臟功能相關(guān)指標(biāo)的變化。應(yīng)用H2S的供體NaHS可以降低L-NAME誘導(dǎo)的大鼠血壓的升高并保護(hù)其肝臟的損傷，下調(diào)血壓的作用可以被KATP通道的阻斷劑格列苯脲阻斷，但苯脲阻斷不能阻斷H2S對肝臟的保護(hù)作用。
　　第二部分 硫化氫通過調(diào)節(jié)eNOS/AKT抗L-NAME所致的大鼠肝臟損傷
　　目的:復(fù)制

9、L-NAME誘導(dǎo)的大鼠模型并外源性給予H2S的供體NaHS和格列苯脲(Gli)，通過檢測血漿中NO和H2S以及使用分子生物學(xué)技術(shù)研究H2S保護(hù)L-NAME所致的大鼠肝臟損傷的作用機(jī)制。
　　方法:健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只，動物隨機(jī)分為6組，分別為:對照（con組），L-NAME組，con+格列苯脲組（con+Gli組），con+硫氫化鈉組（con+NaHS組），L-NAME+NaHS組，L-NAME+NaHS

10、+Gli組，每組各6只。硫氫化鈉組大鼠采用硫氫化鈉（56μmol/kg）每日腹腔射;其余組大鼠每日腹腔注射相應(yīng)劑量的生理鹽水。L-NAME組大鼠給予配制好的L-NAME水溶液每日日常飲用。格列苯脲組大鼠給予配制好的格列苯脲水溶液每日日常飲用。大鼠給予處理5周后，留取血漿和肝臟組織測量血漿H2S的含量，測量肝組織中NO的含量，Western blot法檢測肝臟組織eNOS，P-eNOSs1177, AKT，P-AKTs473蛋白表達(dá)。

11、r>　　結(jié)果:1.血漿H2S含量的變化:con組，con+NaHS組，con+Gli組的血漿H2S含量各組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。L-NAME組血漿H2S較con組明顯降低。L-NAME+NaHS組，L-NAME+NaHS+Gli組的血漿H2S較L-NAME組比明顯升高，但兩組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.肝臟組織NO的變化:con組，con+NaHS組，con+Gli組的肝臟組織NO含量各組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。L-NAME組肝臟組織

12、NO較con組明顯降低。L-NAME+NaHS組，L-NAME+NaHS+Gli組的肝臟組織NO分別較L-NAME組比明顯升高，兩組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.肝臟組織蛋白表達(dá):結(jié)果采用目的蛋白的灰度值與內(nèi)部參照GADPH作比較。con組，con+NaHS組，con+Gli組的肝臟組織eNOS，P-eNOSs1177，AKT，P-AKTs473蛋白表達(dá)各組之間均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。L-NAME組肝臟組織eNOS，P-eNOSs117

13、7，AKT，P-AKTs473蛋白表達(dá)均較con組明顯降低。L-NAME+NaHS組，L-NAME+NaHS+Gli組的肝臟組織eNOS，P-eNOSs1177，AKT，P-AKTs473蛋白表達(dá)均較L-NAME組比明顯升高，但兩組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:本研究證實(shí)應(yīng)用NO合酶的抑制劑L-NAME大鼠血漿H2S和NO含量降低，下調(diào)了肝臟組織eNOS，P-eNOSs1177，AKT，P-AKTs473蛋白的表達(dá)。應(yīng)用H2S的

14、供體NaHS可以上調(diào)L-NAME誘導(dǎo)的大鼠血漿H2S和NO含量，上調(diào)肝臟中與NO合成相關(guān)蛋白的表達(dá)。這種調(diào)節(jié)作用不能被格列苯脲阻斷，即不是通過KATP通道發(fā)揮的作用，可能是通過激活A(yù)KT-eNOS通路起到的。
　　第三部分 硫化氫通過調(diào)節(jié)eNOS/AKT抗L-NAME所致的大鼠肝細(xì)胞損傷
　　目的:通過體外培養(yǎng)原代肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，來探討H2S體外應(yīng)用是否可通過直接調(diào)節(jié)eNOS/AKT途徑而保護(hù)L-NAME所致的大鼠肝細(xì)胞損傷即通

15、過調(diào)節(jié)eNOS/AKT的磷酸化上調(diào)肝臟細(xì)胞一氧化氮的生成。
　　方法:肝臟細(xì)胞的分離和培養(yǎng)參Sprague-Dawley雄性大鼠通過門靜脈灌流消化液方法分離肝臟細(xì)胞，并采用臺盼藍(lán)排斥法測定肝細(xì)胞活力。選取細(xì)胞活率在90％以上的肝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。肝臟原代細(xì)胞分為對照組(con組),con+NaHS(100μmol/L)組，L-NAME(100μmol/L)組，L-NAME(100μmol/L)+NaHS(100μmol/L)組，L-N

16、AME(100μmol/L)+NaHS(100μmol/L)+Gli(100μmol/L)組，L-NAME(100μmol/L)+NaHS（100μmol/L）+LY294002(20μmol/L)組。藥物作用時(shí)間均為8小時(shí)。收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清檢測NO的含量，采用NO的特異性熒光探針DAF-FM DA(3-Amino,4-aminomethyl-2'，7'-difluorescein,diacetate)測量細(xì)胞內(nèi)NO的變化，weste

17、rn blot法檢測肝臟原代細(xì)胞中eNOS，P-eNOSs1177，AKT，P-AKTs473蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論:本研究證實(shí)應(yīng)用NO合酶抑制劑L-NAME后大鼠肝臟原代細(xì)胞NO生成減少，此作用是通過下調(diào)肝臟細(xì)胞P-eNOSs1177，P-AKTs473蛋白的表達(dá)即減低了eNOS，AKT的磷酸化。應(yīng)用H2S的供體NaHS可以上調(diào)肝臟原代細(xì)胞NO的生成和相關(guān)蛋白的表達(dá)。這種調(diào)節(jié)作用不能被格列苯脲阻斷，可以被AKT的阻斷劑LY2940