基于核酸適配體傳感器的蜂蜜中四環(huán)素殘留快速檢測(cè)方法研究.pdf

1、四環(huán)素因其低成本及廣譜抗菌性而被廣泛用于動(dòng)物飼養(yǎng)，導(dǎo)致動(dòng)物源性食品中四環(huán)素殘留普遍，嚴(yán)重危害公眾身體健康并阻礙食品行業(yè)的發(fā)展，急需開發(fā)特異性強(qiáng)、靈敏度高的新型檢測(cè)方法用于復(fù)雜樣品中四環(huán)素殘留的初步快速篩查。生物傳感器包括生物識(shí)別元件和轉(zhuǎn)導(dǎo)元件兩部分，可將識(shí)別元件與靶物質(zhì)之間的特異性結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)為可量化的信號(hào)，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。核酸適配體是一種經(jīng)體外的指數(shù)富集配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選得到的新型識(shí)別“化學(xué)抗體”，具有高親和性、高特異性且易

2、修飾、性質(zhì)穩(wěn)定，可作為生物傳感器中的識(shí)別元件，應(yīng)用于食品安全快速檢測(cè)。
　　本文圍繞蜂蜜中的四環(huán)素殘留的檢測(cè)，分別建立了酶聯(lián)核酸適配體生物傳感器（ELAA-aptasensor）、納米金-核酸適配體生物傳感器（AuNPs-aptasensor）、表面等離子共振-核酸適配體生物傳感器(SPR-aptasensor)及電化學(xué)-核酸適配體傳感器(EC-aptasensor)，用于實(shí)際樣品中四環(huán)素的快速檢測(cè)。同時(shí)，本文將虛擬分子對(duì)接與化學(xué)

3、實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，不僅探究了核酸適配體與四環(huán)素的分子識(shí)別機(jī)制，而且揭示了不同核酸適配體在應(yīng)用時(shí)具有體系“適用性”特點(diǎn)，可有依據(jù)地選擇最佳適配體輔助構(gòu)建生物傳感器。具體研究成果如下:
　　1、四種不同的生物傳感方法均可應(yīng)用于簡(jiǎn)單前處理后的樣品，實(shí)現(xiàn)對(duì)蜂蜜中的四環(huán)素的快速檢測(cè)，加標(biāo)回收率均在85～120％之間，準(zhǔn)確性高，且抗干擾能力強(qiáng)，可對(duì)四環(huán)素特異性識(shí)別。
　　2、首先，利用Apt76構(gòu)建了間接競(jìng)爭(zhēng)、直接競(jìng)爭(zhēng)兩種模式的ELAA-ap

4、tasensor，用于蜂蜜中四環(huán)素的高通量快速檢測(cè)，引入鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)分子固定和信號(hào)放大，并對(duì)其他各反應(yīng)條件進(jìn)行了細(xì)致優(yōu)化。在最佳條件下，間接競(jìng)爭(zhēng)ELAA-aptasensor對(duì)四環(huán)素的線性檢測(cè)范圍為0.01～100 ng·mL-1，檢測(cè)限為0.00966 ng·mL-1。直接競(jìng)爭(zhēng)ELAA-aptasensor的線性檢測(cè)范圍為0.1～1000 ng·mL-1，檢測(cè)限為0.0978 ng·mL-1。將兩種ELAA-aptase

5、nsor與ELISA進(jìn)行比較確證，三種方法具有相當(dāng)?shù)募訕?biāo)回收率，并且ELAA-aptasensor的靈敏度高于ELISA。
　　3、兩條不同的核酸適配體Apt76和Apt40在ELAA-aptasensor中應(yīng)用時(shí)的明顯差異引發(fā)了對(duì)核酸適配體識(shí)別機(jī)制的猜想，故將分子對(duì)接軟件與ITC滴定法相結(jié)合，探究了Apt76、Apt40與四環(huán)素的本征分子識(shí)別機(jī)制。實(shí)驗(yàn)表明，(1) Apt76和Apt40形成不同的空間結(jié)構(gòu)并含有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，以“

6、口袋”的形式將四環(huán)素包裹，且核酸適配體結(jié)合位點(diǎn)的個(gè)數(shù)、空間結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性與核酸適配體的堿基組成、單鏈長(zhǎng)度及二級(jí)結(jié)構(gòu)中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，Apt76比Apt40具有更多結(jié)合位點(diǎn);(2)不同的空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)分布導(dǎo)致核酸適配體具有體系“適用性”，Apt76比較適合在如ELAA-aptasensor的需要化學(xué)修飾或固定的研究中使用，Apt40可運(yùn)用于無需標(biāo)記的傳感方法。
　　4、結(jié)合分子識(shí)別研究，從Apt40的長(zhǎng)度、堿基組成、二級(jí)結(jié)構(gòu)、

7、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析了Apt40、納米金、四環(huán)素三者之間的相互作用，并基于Apt40對(duì)納米金的保護(hù)作用構(gòu)建了無需標(biāo)記的AuNPs-aptasensor，可視化半定量后，結(jié)合紫外可見吸收值進(jìn)行精確定量，30 min內(nèi)可完成全部分析。在20～320 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)，四環(huán)素濃度的對(duì)數(shù)值與響應(yīng)信號(hào)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，檢測(cè)限為12.4 ng·mL-1。
　　5、基于核酸適配體的“體系適用性”特點(diǎn)，將Apt76修飾固定于SPR芯片表面構(gòu)建SP

8、R-aptasensor，依托Biacore T200實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化快速檢測(cè)。將鏈霉親和素共價(jià)偶聯(lián)到CM5芯片表面，然后通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)將Apt76固定在芯片表面，直接捕獲流經(jīng)芯片表面的四環(huán)素分子并同時(shí)產(chǎn)生SPR響應(yīng)信號(hào)。在0.01～100 ng·mL-1范圍內(nèi)，SPR信號(hào)與四環(huán)素濃度對(duì)數(shù)值成正比，檢測(cè)限為0.183 ng·mL-1。
　　6、相似地，將巰基修飾的Apt76固定于絲網(wǎng)印刷電極表面，構(gòu)建EC-aptasenso