1、研究目的:
本課題研究在常染色體顯性多囊腎病(Autosomal Dominant Polycystic KidneyDisease,ADPKD)的微環(huán)境中,囊腫襯里上皮細(xì)胞趨化巨噬細(xì)胞募集至囊腫周圍并使其發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制,并進(jìn)一步探討巨噬細(xì)胞刺激囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖的機(jī)制,兩者相互影響,進(jìn)而促進(jìn)多囊腎病的疾病進(jìn)展。
實(shí)驗(yàn)方法:
1.在Pkd1誘導(dǎo)敲除小鼠腎臟組織中,觀察病程的進(jìn)展與腎組織中乳酸濃度的關(guān)系
2、。
2.在Pkd1誘導(dǎo)敲除小鼠腎臟組織中,觀察腎組織中乳酸水平和囊腫指數(shù)的相關(guān)性。
3.收集OX161和UCL93細(xì)胞的條件培養(yǎng)液,檢測(cè)條件培養(yǎng)液中乳酸含量,酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)兩種細(xì)胞的條件培養(yǎng)液中MCP-1的濃度變化。
4.予以乳酸刺激RAW264.7細(xì)胞,用RT-PCR法、蛋白免疫印跡法和細(xì)胞免疫熒光法分別從基因、蛋白等水平檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中ARG1的表達(dá)量。
5.予以乳酸刺激RAW2
3、64.7細(xì)胞,收集RAW264.7條件培養(yǎng)液,用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)條件培養(yǎng)液中ARG1的濃度變化。
6.予以乳酸刺激RAW264.7細(xì)胞,收集RAW264.7細(xì)胞,用ARG1活性檢測(cè)法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ARG1的活性變化。
7.建立穩(wěn)定的二維共培養(yǎng)體系:即OX161/UCL93+RAW264.7細(xì)胞Transwell共培養(yǎng),并在該體系中加入ARG1競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑—Nor-NOHA,用EdU法檢測(cè)增殖期的陽(yáng)性細(xì)胞
4、核數(shù)目,計(jì)算處于增殖期細(xì)胞的百分比;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期所占百分比。
8.在OX161細(xì)胞培養(yǎng)液中加入重組的人ARG1細(xì)胞因子和ARG1競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑—Nor-NOHA,用EdU法檢測(cè)增殖期的陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)目,計(jì)算處于增殖期細(xì)胞的百分比;流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)細(xì)胞周期所占百分比,用蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞增值通路蛋白的表達(dá)變化。
結(jié)果:
1.Pkd1誘導(dǎo)敲除小鼠,隨多囊腎疾病進(jìn)展,腎臟囊腫指數(shù)增大,腎組織中乳酸濃度增
5、高。
2.囊腫襯里上皮細(xì)胞分泌趨化因子MCP-1,募集巨噬細(xì)胞至囊腫周圍;同時(shí)產(chǎn)生乳酸,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2表型,表達(dá)并分泌有活性的ARG1。
3.ARG1能夠刺激囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖,進(jìn)而促進(jìn)囊腫的增大和多囊腎病疾病進(jìn)展。
結(jié)論:
多囊腎病疾病進(jìn)程中,囊腫襯里上皮細(xì)胞分泌趨化因子MCP-1募集巨噬細(xì)胞分布在囊腫周圍。隨著囊腫進(jìn)行性增大,腎組織缺氧加重,乳酸濃度增加,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型分化,表
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