新型PPARγ激動劑DH9抑制多囊腎囊腫襯里上皮細胞增殖的作用和機制研究.pdf

1、本研究由三部分組成： 一、β-catenin在ADPKD腎組織中的表達及分布 采用免疫組織化學染色技術觀察β-catenin在人及ADPKD動物模型PKDV/V小鼠多囊腎組織中及相應正常腎組織中的定位；蛋白免疫印跡法檢測β-catenin在正常腎組織和多囊腎組織中的表達。本部分旨在觀察β-catenin在多囊腎組織及正常腎組織中的表達分布差異，并初步探討β-catenin在多囊腎病發(fā)病中促進其增殖的作用機制。結果顯示：在

2、人正常腎組織中，β-catenin主要分布在腎小管上皮細胞的胞膜上，胞漿及胞核未見明顯的棕黃色染色；而在人ADPKD腎組織的非囊腫腎組織中，我們發(fā)現(xiàn)雖然小管結構尚可，但β-catenin已經失去正常的胞膜分布，異位至胞漿中，但胞核內少見；而在人ADPKD多囊腎組織中，正常腎小管形態(tài)消失，被大小不等的囊泡取代，β-catenin在胞漿中表達明顯增多，并且異位至胞核中。在PKDv/v小鼠中，β-catenin異位至胞核，呈強陽性表達，明顯高

3、于野生型C57BL/6小鼠。Westernblot技術檢測到人的多囊腎組織β-catenin蛋白表達高于正常腎組織(P＜0.05)；PKDv/v小鼠的腎組織比同周齡的野生型C57BL/6小鼠β-catenin蛋白表達明顯增多(P＜0.01)。以上結果證實作為經典的Wnt/β-catenin信號通路“分子開關”β-catenin在多囊腎組織中的定位存在胞膜-胞漿-胞核的轉位現(xiàn)象，并且其表達明顯升高，說明了在人的多囊腎發(fā)病過程中，β-cat

4、enin與囊腫襯里上皮細胞的高度增殖和細胞間黏附力減弱、細胞極性倒置密切相關。 二、新型PPARγ激動劑(DH9)對人囊腫襯里上皮細胞(WT9-12)增殖抑制的研究 采用不同濃度的DH9藥物作用WT9-12細胞24、48、72、96h，并與羅格列酮做比較，噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖情況；做如下實驗分組：DH9藥物單作用組、蛋白酶體抑制劑MG132+DH9共處理組、GSK3β抑制劑SB216763+DH9共處理組、PP

5、ARγ抑制劑GW9662+DH9共處理組分別干預WT9-12細胞72小時后，收集細胞裂解總蛋白，根據實驗目的予蛋白免疫印跡技術分別檢測β-catenin、磷酸化β-catenin、GSK3β、磷酸化GSK3β的蛋白水平；RT-PCR方法測定β-cateninmRNA水平。此部分實驗旨在比較噻唑烷二酮類的PPAR-γ激動劑羅格列酮及羧酸類新型PPARγ激動劑DH9藥物對WT9-12細胞增殖抑制作用的差異，并研究DH9對WT9-12的增殖抑

6、制作用與經典的Wnt/β-catenin信號通路的關系，并初步探討DH9藥物影響β-catenin可能的機制。結果顯示：不同濃度羅格列酮干預WT9-12細胞起效時間長，所需濃度高，在72小時后才顯著發(fā)揮其抑制細胞增殖的效應，與羅格列酮相比，DH9藥物24小時即可起效，48小時可有明顯的增殖抑制效應。相同濃度的DH9及羅格列酮干預72小時發(fā)現(xiàn)DH9的增殖抑制作用明顯優(yōu)于羅格列酮(P＜0.01)，在加入GW9662預處理2小時后，再分別予D

7、H9和羅格列酮共處理72小時，發(fā)現(xiàn)加入GW9662前后均不能阻斷DH9和羅格列酮的抗增殖效應。DH9可減少WT9-12細胞β-catenin的蛋白表達，其抑制作用具有時間依賴性；給予DH9藥物濃度越大，細胞β-catenin的蛋白表達量逐漸減低，失活形式的磷酸化β-catenin表達增多，顯示DH9對β-catenin的作用具有明顯的劑量依賴性；但DH9對WT9-12細胞β-catenin mRNA水平無明顯變化。DH9對活性形式的GS

8、K3β無明顯改變，但可以上調其磷酸化GSK3β的蛋白表達；在給予MG132或者SB216763預處理后與DH9共處理72小時，可逆轉DH9對β-catenin的下調作用，但GW9662無此作用。綜合以上結果說明DH9較羅格列酮可顯著抑制WT9-12細胞增殖，這種增殖抑制作用可通過蛋白酶體的作用以及GSK3β依賴的方式下調β-catenin的蛋白表達從而抑制Wnt/β-catenin信號通路實現(xiàn)，與PPARγ途徑無關。 三、新型P

9、PARγ激動劑(DH9)對囊腫襯里上皮細胞周期及凋亡的影響 采用流式細胞術檢測DH9藥物作用72小時觀察細胞周期的改變，蛋白免疫印跡分析DH9藥物對P21CIP/WAF1和cyclinA蛋白表達的影響；AnnexinV+PI雙染色流式細胞術測定細胞的凋亡率，Western blot方法分析Bcl-2及Bax表達。本實驗旨在觀察DH9對WT9-12細胞增殖的抑制與細胞周期和凋亡的關系，并初步探討其作用機制。結果顯示：DH9作用72

10、小時能夠阻止WT9-12細胞的細胞周期進程，表現(xiàn)為誘導S期停滯，減少進入G2/M期的細胞數(shù)量；隨DH9干預濃度的升高P21CIP/WAF1蛋白表達逐漸增強而cyclinA的表達逐漸減弱。AnnexinV+PI雙染色流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)DH9可以誘導細胞凋亡。40、60、80μM DH9作用WT9-12細胞72小時后，凋亡率分別為4.28±0.29％，10.83±0.58％和18.72±0.46％，顯著高于對照組3.69±0.25％，Wes

11、tern blot結果顯示Bcl-2的蛋白表達量逐漸減少，而Bax的表達量逐漸增多。本部分實驗得出：DH9能夠通過阻斷WT9-12細胞細胞周期進程，表現(xiàn)為S期阻滯；通過下調Bcl-2/Bax比值誘導凋亡從而抑制WT9-12細胞增殖。 綜合三部分結果，我們得出結論：β-catenin在ADPKD腎組織中存在異常分布及表達；DH9可通過下調β-catenin的表達影響Wnt/β-catenin信號轉導通路、阻斷細胞S期進程、誘導凋亡