呼吸道上皮細胞與致病菌相互作用——上皮細胞內(nèi)吞細菌實驗研究.pdf

1、呼吸道上皮細胞是呼吸道防御微生物感染的第一道屏障。上皮細胞不僅僅是一道阻隔病原體入侵的機械屏障，更是天然免疫及炎癥反應的積極參與者。綠膿桿菌和克雷伯桿菌都是機會致病菌，對正常人不致病，只有免疫功能低下和粘膜上皮細胞受損或功能失常時才會發(fā)生感染。呼吸道上皮細胞在防御這類機會致病菌感染時發(fā)揮了重要的作用。本研究旨在探討上皮細胞能否清除進入胞內(nèi)的綠膿桿菌，胞內(nèi)模式識別受體Nods蛋白信號途徑是否參與清除細菌的過程，以及防御素是否能通過促經(jīng)克雷

2、伯桿菌粘附到上皮細胞而被上皮細胞內(nèi)吞并清除。 首先用綠膿桿菌活菌刺激支氣管原代培育上皮細胞及A549細胞，活菌細胞共孵育兩小時后慶大霉素殺死細胞外的細菌，分別于實驗4小時，24小時用TritonX-100裂解細胞，采用平板培養(yǎng)菌落計數(shù)法計數(shù)胞內(nèi)活菌數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌在上皮細胞內(nèi)被逐漸減少，提示上皮細胞可以清除胞內(nèi)細菌。綠膿桿菌與細胞按不同比例共孵育兩小時后慶大霉素殺死未進入胞內(nèi)的細菌，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后收集細胞培養(yǎng)上清，酶聯(lián)免

3、疫吸附法(ELISA)檢測IL-8的表達量，結(jié)果觀察到活菌可以刺激上皮細胞IL-8分泌增加。 進一步的實驗探討了Nods蛋白是否參與上皮細胞清除細菌的過程，以及活菌在胞內(nèi)誘導IL-8分泌是否通過Nods受體信號。用超聲處理獲得綠膿桿菌菌體成，采用溫和去污劑digitonin處理A549細胞使細胞膜通透性增加，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌菌體成分顯著誘導digitonin處理過的細胞IL-8表達水平，為對照的3倍，而未經(jīng)digitonin處理

4、的細胞IL-8表達水平增加不超過對照的1倍，提示菌體成分是胞內(nèi)誘導炎癥反應有效的刺激物，胞內(nèi)模式識別受體Nod1，Nod2可能參與呼吸道上皮細胞的炎癥防御反應。用RT-PCR檢測呼吸道上皮細胞Nod1，Nod2的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上皮細胞表達Nod1及Nod2。為了進一步研究胞內(nèi)模式識別受體Nod1、Nod2是否參與細胞內(nèi)清除細菌的過程，構(gòu)建了Nod1及Nod2CARD結(jié)構(gòu)域缺失的突變重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染A549細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變Nod2抑制了上

5、皮細胞清除胞內(nèi)細菌的能力，而突變Nod1對上皮細胞清除細菌的能力沒有影響。 我們進一步假設(shè)，是否可以通過促進細菌對上皮細胞的粘附而增強上皮細胞清除細菌。我們將人α-防御素(HNP)、克雷伯桿菌、上皮細胞共孵育四小時，采用平板培養(yǎng)菌落計數(shù)法計數(shù)粘附細胞的活菌數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HNP顯著促進細菌的粘附(增加12倍)。將HNP、克雷伯桿菌、細胞共孵育四小時后慶大霉素殺死未進入胞內(nèi)的細菌，繼續(xù)孵育2小時，用TritonX-100裂解細胞，結(jié)果