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文檔簡介
1、目的:
通過建立同系(C57BL/6J)小鼠腎缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)模型觀察血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)、核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa B,NF-κ B)、低氧誘導因子(hypoxia inducible fa
2、ctor-lalpha,HIF-1α)和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)在缺血再灌注腎組織中的表達變化以及高壓氧(hyperbaric oxygenation,HBO)治療對這些因子表達的影響,進一步研究缺血再灌注后腎組織的病理生理改變以及HBO對缺血再灌注腎損傷的治療作用和機制。
方法:
將C57BL/6J小鼠隨機分為正常對照組、假手術組、腎缺血組、HBO
3、+腎缺血組、腎IR組、腎IR﹢HBO治療組,然后再分別將IR組及IR﹢HBO治療組分為1h、3h、6h、12h、24h組,每小組6只小鼠。正常對照組及切開小鼠腹腔立即處死小鼠取雙腎,假手術組僅切開腹腔后便將腹腔關閉;腎缺血組:切開腹腔,雙側(cè)腎蒂阻斷45min后,立即處死小鼠,采血并切取腎臟標本;缺血+HBO組:在進行腎缺血組相同處理前對小鼠進行1h高壓氧治療;腎IR組:切開腹腔,雙側(cè)腎蒂阻斷45min后開放血流,分別于再灌注后1、3、6
4、、12、24h切取雙腎并采取靜脈血;IR﹢HBO治療組:切開腹腔,雙側(cè)腎蒂阻斷45min后開放血流,分別于再灌注后0、2、5、11、23h時行HBO治療,治療1h后切取雙腎并采取靜脈血,雙側(cè)腎蒂不阻斷,于相應時點切取雙腎并采取靜脈血。采用HE染色觀察腎組織的病理改變,免疫組織化學法檢測 VEGF、BCL-2、NF-κ B和 HIF-1α在腎組織中的表達,實時熒光定量PCR(real-time PCR)檢測VEGF、CTGF的表達以及全自
5、動生化分析儀檢測血清肌酐(SCr)。
結(jié)果:
1.腎功能變化:結(jié)果顯示,假手術組與正常對照組血肌酐無明顯差異,腎缺血組和HBO+腎缺血組的血肌酐值明顯高于假手術組(P<0.05),在HBO治療后,腎缺血引起的腎功能損害有改善但不明顯。再灌注后腎功能損害加重,且隨著再灌注時間的延長逐漸加重,在再灌注24h時損傷最重。HBO治療則明顯改善了再灌注后的腎功能,以1h、3h、6h和12h時突出,24小時后高壓氧治療對腎功能的
6、保護作用減弱。
2.腎組織病理變化:正常對照組和假手術組可見腎小管細胞無明顯病理改變,缺血組及缺血+HBO組可見腎小管細胞明顯腫脹,HBO治療后腎小管細胞腫脹程度較前有輕微好轉(zhuǎn),IR組于1h時,可見系膜細胞輕度增生,腎間質(zhì)血管輕度擴張充血,腎小球體積輕度增大,腎小管上皮細胞輕度腫脹;于3h時,可見腎小管上皮細胞腫脹進一步加重,呈顆粒樣變性,組織血管充血;于6h時,可見腎腎小管細胞已經(jīng)逐漸失去細胞原有形態(tài),腎小管上皮細胞腫脹進一
7、步加重,伴少量中性粒細胞浸潤,12h及24h可見大量的小管細胞破壞,腎小管細胞出現(xiàn)了相互融合,細胞結(jié)構(gòu)被完全破壞,并出現(xiàn)少量核碎裂核溶解,并出現(xiàn)大量的的中性粒細胞浸潤。經(jīng)過高壓氧治療后各時間點均可見腎小管細胞腫脹明顯減輕,細胞破壞明顯減少,核溶解現(xiàn)象也有所減少。
3.免疫組織化學法檢測VEGF、BCL-2、NF-κ B和HIF-1α在腎組織中的表達:
?。?)腎組織VEGF蛋白的表達變化:VEGF蛋白主要表達于腎小管上
8、皮細胞胞質(zhì),細胞核少量表達,高壓氧治療后胞核及胞質(zhì)表達均增加。相對定量結(jié)果顯示,腎缺血組、HBO+腎缺血組、腎IR組及腎IR+HBO組VEGF蛋白的表達均顯著高于正常對照組和假手術組(P<0.05),而在腎缺血前運用高壓氧治療可見VEGF表達增加(P<0.05)。腎IR后,VEGF的表達較假手術組呈持續(xù)性上升并在6h達到峰值(P<0.05),12h后開始表現(xiàn)出下降趨勢但仍高于假手術組(P<0.05);經(jīng)高壓氧治療后,腎IR+HBO組 V
9、EGF對應各時間點的表達相較于腎IR組有明顯的增加并且在6h增加最為明顯(P<0.05)。
?。?)腎組織HIF-1α蛋白的表達變化:HIF-1α蛋白主要表達于腎小管細胞的胞質(zhì),細胞核有少量表達。相對定量結(jié)果顯示,腎缺血組、HBO+腎缺血組、腎IR組及腎IR+HBO組HIF-1α蛋白的表達均顯著高于正常對照組和假手術組(P<0.05),而在腎缺血前運用高壓氧治療可見HIF-1α表達增加,但并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。腎缺血再
10、灌注損傷發(fā)生后,HIF-1α的表達呈持續(xù)性上升并在6h達到峰值(P<0.05),12h后開始表現(xiàn)出下降趨勢但仍高于假手術組(P<0.05);經(jīng)高壓氧治療后,HIF-1α的表達各時間點相比較于腎IR組有明顯的增加并且在6h增加最為明顯(P<0.05)。
?。?)腎組織Bcl-2蛋白的表達變化:Bcl-2蛋白主要表達于腎小管上皮細胞胞質(zhì),細胞核少量表達。相對定量結(jié)果顯示,腎缺血組、HBO+腎缺血組、腎IR組及腎IR+HBO組Bcl-
11、2蛋白的表達均顯著高于正常對照組和假手術組(P<0.05),而在腎缺血前運用高壓氧治療可見Bcl-2表達增加,但并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。腎缺血再灌注損傷發(fā)生后,Bcl-2的表達呈持續(xù)性上升并在3-6h達到峰值(P<0.05),12h后開始表現(xiàn)出下降趨勢但仍高于假手術組(P<0.05);經(jīng)高壓氧治療后,Bcl-2蛋白各時間點的表達相比較于腎IR組均有明顯的增加并且在3-6h增加最為明顯(P<0.05)。
?。?)腎組織NF
12、-κ B蛋白的表達變化:NF-κ B蛋白主要表達于腎小管上皮細胞胞質(zhì),細胞核少量表達。相對定量結(jié)果顯示,腎缺血組、HBO+腎缺血組、腎IR組及腎IR+HBO組NF-κ B蛋白的表達均顯著高于正常對照組和假手術組(P<0.05),而在腎缺血后運用高壓氧治療預處理可見NF-κ B表達無顯著差異(P>0.05)。腎缺血再灌注損傷發(fā)生后,NF-κ B的表達呈持續(xù)性上升并在6h達到峰值,12h后開始表現(xiàn)出下降趨勢但仍高于假手術組(P<0.05);
13、經(jīng)高壓氧治療后,NF-κ B各時間點的表達相比較于腎IR組有明顯的減少并且在6h減少最為明顯(P<0.05)。
4.實時熒光定量PCR(real-time PCR)檢測腎組織VEGF mRNA、CTGF mRNA的表達變化:
?。?)腎組織VEGF mRNA的表達變化:腎缺血組、HBO+腎缺血組,腎IR組及腎IR+HBO組VEGF mRNA的表達量較正常對照組和假手術組均增加(P<0.05),經(jīng)高壓氧治療后HBO+腎缺
14、血組VEGF mRNA的表達高于腎缺血組(P<0.05)。腎IR時VEGF mRNA的表達隨著時間的延長逐漸增加并在6h達到峰值(P<0.05),12h后表達開始逐漸下降。當經(jīng)過高壓氧治療后我們可以發(fā)現(xiàn)腎IR+HBO治療組各時間點VEGF mRNA的表達相比較于腎IR組在1h、3h、6h、12h均有明顯增加(P<0.05),24h無明顯差異(P>0.05)。
?。?)腎組織CTGF mRNA的表達變化:腎缺血組、HBO+腎缺血組
15、、腎IR組及腎IR+HBO組CTGF mRNA的表達均顯著高于正常對照組和假手術組(P<0.05),而在腎缺血后運用高壓氧治療預處理可見CTGF mRNA表達無顯著差異(P>0.05)。腎缺血再灌注損傷發(fā)生后,CTGF mRNA的表達呈持續(xù)性上調(diào)(P<0.05);經(jīng)高壓氧治療后,6h后各時間點相比較于腎IR組CTGF mRNA的表達有明顯的減少(P<0.05)。
結(jié)論:
1.HBO治療可以通過HIF-VEGF-Not
16、ch通路顯著改善缺血再灌注腎組織的缺氧狀態(tài),促進新生血管的生成,從而減輕腎缺血再灌注損傷。
2.HBO治療可以減少CTGF表達,通過減少致纖維化因子的表達在對于腎缺血再灌注損傷中減輕腎臟損傷,對腎臟起到保護作用。
3.HBO治療可以通過增加Bcl-2的表達并減少NF-κ B的表達,對細胞凋亡上游因子的調(diào)控,從而對腎臟在缺血再灌注損傷中起到了保護作用。
4.HBO治療在腎缺血再灌注早期便開始發(fā)揮保護作用,對于
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