轉(zhuǎn)移因子的提取及聚肌胞的體外降解研究.pdf

1、轉(zhuǎn)移因子(TransferFactor，TF)，是由免疫細胞產(chǎn)生可以將免疫信息轉(zhuǎn)移到其它個體的一類多肽與核酸的混合物。本實驗通過對透析液中多肽和核糖核酸含量的測定，比較了反復(fù)凍融法和細胞裂解液處理法這兩種方法對轉(zhuǎn)移因子提取效果的差異，并進一步討論了凍融法中不同解凍方式和凍融次數(shù)對轉(zhuǎn)移因子收率的影響。在用細胞裂解液處理脾臟淋巴細胞時，通過細胞計數(shù)的方法確定了Tris的基本濃度，同時比較了不同SDS濃度裂解液對細胞破碎效果的差異。
　

2、　 聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic，polyI:C)是由聚肌苷酸和聚胞苷酸通過堿基互補配對形成的雙鏈RNA，是一種高效的干擾素誘導(dǎo)劑。本研究首次用基于SYBRGreenⅠ熒光染料與雙鏈RNA(dsRNA)結(jié)合產(chǎn)生熒光，加熱使雙鏈解開引起熒光減弱的原理，建立一種對特定雙鏈聚肌胞含量檢測的方法。同時通過對聚肌胞在兔血清和雞血清中的降解的檢測，初步了解聚肌胞在這兩種動物機體內(nèi)的降解情況?，F(xiàn)研究結(jié)果如下:

3、　　 1.脾臟組織用去注射水勻漿比用生理鹽水勻漿的效果更好，表明注射水與脾臟細胞膜之間形成的滲透壓差更容易破碎細胞膜，使其內(nèi)容物釋放出來;反復(fù)凍融6次時的轉(zhuǎn)移因子中多肽濃度和核酸含量最高，過多的凍融次數(shù)反而會使轉(zhuǎn)移因子中的多肽和核酸的含量變少，這可能是過多的反復(fù)解凍會對多肽和核酸產(chǎn)生破壞，致使其含量降低;同時，也會使細胞內(nèi)溶酶體裂解，釋放出水解酶，水解了轉(zhuǎn)移因子中的多肽物質(zhì)。上清液透析24小時轉(zhuǎn)移因子的的率最高。同樣的，透析時間延長并

4、不能使透析液中的轉(zhuǎn)移因子的含量增加，反而會減少。在化學(xué)破碎法提取轉(zhuǎn)移因子時，先通過鏡檢細胞計數(shù)確定化學(xué)裂解液的初步配方。確定Tris含量為2.5％時細胞破碎率更高。通過不同濃度SDS的用量，不同透析時間的選擇，發(fā)現(xiàn)SDS含量為0.7％，透析24小時的轉(zhuǎn)移因子的含量最高。這兩種方法為工業(yè)提取轉(zhuǎn)移因子提供了工藝參考基礎(chǔ)。
　　 2.通過用SYBRGreenⅠ熒光染料與聚肌胞結(jié)合，用熒光定量PCR測定其融解曲線，發(fā)現(xiàn)聚肌胞濃度在0.0

5、25mg/ml～2mg/ml之間線性關(guān)系良好，由于融解曲線能特定反映的是雙鏈核酸的解鏈溫度時的熒光量和完全解鏈后的熒光量的差值與溫度的變化，故此方法能特定檢測dsRNA或dsDNA，特異性較高，解決了以前熒光法、紫外分光法和定磷法等的特異性差的缺點;實驗發(fā)現(xiàn)不同動物血清中RNA酶活性對聚肌胞的降解作用有差異，其中，雞血清對聚肌胞的降解最明顯，而兔血清對聚肌胞降解稍差。雞血清在加入聚肌胞以后4小時和24小時的熒光量幾乎沒有變化，一直比較低