暗紋東方鲀(Takifugu obscurus)性腺分化的組織學(xué)及芳香化酶基因(CYP19A)表達(dá)的研究.pdf

1、性別決定和性別分化在脊椎動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育史中是兩個(gè)重要的過程,高等脊椎動(dòng)物的性別決定占有重要地位,性別受細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)影響較大。而對于低等脊椎動(dòng)物,如魚類,其性腺的分化則還受到環(huán)境等多方面的影響。研究魚類性腺的分化規(guī)律對研究脊椎動(dòng)物進(jìn)化史和發(fā)育史具有重要的意義。暗紋東方鲀(Takifugu obscurus)屬硬骨魚綱、輻鰭亞綱、鱸形總目、純形目、純科、東方純屬,是我國重要的養(yǎng)殖魚類之一,兼具藥用和食用價(jià)值,養(yǎng)殖前景廣泛。本文利用組織學(xué)方法

2、,對暗紋東方純性腺進(jìn)行組織學(xué)觀察,對其仔魚發(fā)育過程中,性腺的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行了描述,確定了其性腺分化的關(guān)鍵時(shí)間節(jié)點(diǎn)。利用分子學(xué)手段,對暗紋東方純性腺分化關(guān)鍵限速酶的編碼基因CYP19A進(jìn)行real-time PCR,確定CYP19A在性腺分化過程中的作用。為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 對暗紋東方鲀仔魚性腺分化過程進(jìn)行組織學(xué)切片發(fā)現(xiàn):孵化后11d(11dah,day afterhatching)仔魚膀胱基部與直腸之間的體腔膜上出現(xiàn)

3、原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cell,PGC),細(xì)胞體積大,直徑約7μm,胞質(zhì)著色較淺,核大且透亮,核膜清晰、界限明顯,約占細(xì)胞體積的1/2～2/3,核仁偏位,嗜堿性強(qiáng),被染成藍(lán)色;14dah時(shí)PGCs增多,緊貼于體腔膜與體細(xì)胞(Somatic cells,SC)生成一對組織突起,該結(jié)構(gòu)即為性腺原基(Gonad anlag,GA);29dah性腺原基發(fā)育成為原始性腺(Primary gonads,PG),若干PGCs被

4、SCs包裹,從體腔膜上游離出來。35dah時(shí)性腺己出現(xiàn)分化,部分個(gè)體出現(xiàn)原始卵巢腔(Ovarian cavity,Oc);而另一部分個(gè)體性腺在40dah時(shí)觀察到精原細(xì)胞(Spermatogonia,Sg),并伴隨有裂隙狀輸精管原基(Spermaduct anlag,Sd)的出現(xiàn)。47dah時(shí)原始精小葉和輸精管的形成,且在生殖上皮附近及基質(zhì)中出現(xiàn)了Ⅰ時(shí)相卵原細(xì)胞,細(xì)胞呈圓形,胞質(zhì)較少,嗜堿性,被染成淺紫色。直徑在17～20μm之間,核染色

5、較淺,核徑10～12μm。卵巢與精巢在細(xì)胞學(xué)上完成分化分別以其性母細(xì)胞的出現(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn),時(shí)間分別為115dah和81dah,至此,卵巢和精巢才真正完成了分化過程。
　　 芳香化酶(P450arom)是細(xì)胞色素P450家族中的一員,在魚類性別分化過程中起到關(guān)鍵性作用,可催化雄烯二酮和睪酮轉(zhuǎn)化為雌酮和雌二醇。以暗紋東方純二齡魚為實(shí)驗(yàn)材料,根據(jù)已知魚類的CYP19A序列設(shè)計(jì)兼并引物,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出芳香化酶編碼基因CYP19A的片段,

6、長度為1446bp,發(fā)現(xiàn)與其他物種CYP19A cDNA具有86％以上的同源性,具有較高的保守性。而在與CYP19B進(jìn)行Spidey比對時(shí),發(fā)現(xiàn)同源性極低。
　　 根據(jù)獲得的CYP19A基因的序列片段設(shè)計(jì)real-time PCR引物,對不同發(fā)育階段暗紋東方純雌雄魚體內(nèi)的CYP19A基因表達(dá)進(jìn)行real-time PCR發(fā)現(xiàn):雌魚體內(nèi)CYP19A基因表達(dá)遠(yuǎn)高于雄性,這與CYP19A基因的生理特性有密切關(guān)系。在雌魚體內(nèi),CYP19

7、A基因的表達(dá)在44dah時(shí)出現(xiàn)了高峰。結(jié)合組織學(xué)研究結(jié)果,47dah時(shí),PGC正通過有絲分裂進(jìn)行增殖,且在生殖上皮附近及基質(zhì)中出現(xiàn)了Ⅰ時(shí)相卵原細(xì)胞,說明CYP19A的高度表達(dá),產(chǎn)生了大量的芳香化酶,催化雄烯二酮和睪酮轉(zhuǎn)化為雌酮和雌二醇,參與性腺結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和卵母細(xì)胞的生成和發(fā)育。但是,隨著時(shí)間雄性體內(nèi)的CYP19A表達(dá)也有逐漸增高的趨勢,可能芳香化酶在雄性發(fā)育過程中也具有某些作用,這還需要在將來的研究中進(jìn)一步的探討。
　　 通過組