靶向納米載體介導(dǎo)基因治療子宮內(nèi)膜異位癥的療效及機(jī)制研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs，以下簡(jiǎn)稱(chēng)內(nèi)異癥）是指具有生長(zhǎng)功能的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔以外的身體其它部位，它是一種嚴(yán)重影響婦女身心健康和生活質(zhì)量的婦科常見(jiàn)病。內(nèi)異癥的發(fā)病原因及機(jī)理至今仍然不清，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，在育齡婦女中其發(fā)病率幾乎超過(guò)15％。該病所具有的良性病本質(zhì)、惡性生物學(xué)行為如侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等潛能使之成為難以治愈、危害頗大的生殖系統(tǒng)疾病之一。
　　目前臨床治療內(nèi)異癥的方法主要是選擇藥物和手

2、術(shù)治療，雖能不同程度地緩解癥狀，縮小病灶，但可能出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)和復(fù)發(fā)。因此，有必要積極研究?jī)?nèi)異癥的發(fā)生機(jī)理，探索更優(yōu)費(fèi)效關(guān)系的治療內(nèi)異癥手段，才能從根本上解決內(nèi)異癥的主要臨床問(wèn)題。
　　基因治療(gene therapy)是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的的一種治療方法。目前人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成為基因治療打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并將對(duì)醫(yī)藥工業(yè)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。最新大量研究報(bào)道基因治療可

3、用于腫瘤等難治性疾病，并取得了一定成效。同樣我們認(rèn)為，基因治療也可用于具有良性病本質(zhì)和惡性生物學(xué)行為的子宮內(nèi)膜異位癥的根本治療。比如使用siRNA干擾技術(shù)靜默水通道基因表達(dá)，減少或抑制水通道蛋白的表達(dá);再如采用上調(diào)PEDF蛋白的表達(dá)，抑制新生血管的生成，從而有望成為治療內(nèi)異癥的新方法。
　　然而，目前基因治療技術(shù)需解決的最大問(wèn)題之一，是尋找一種安全有效的基因載體遞送系統(tǒng)。非病毒載體由于具有制備簡(jiǎn)單、無(wú)免疫原性、且安全性高等優(yōu)點(diǎn)備受

4、研究者關(guān)注。在傳遞基因方面，最常使用的是陽(yáng)離子載體，以脂質(zhì)體和微粒居多，這些研究在不同程度上取得了一些成功，但基因治療成功率與其數(shù)量成正比，必須盡可能多的量傳遞至細(xì)胞質(zhì)才能獲得理想的生物學(xué)效應(yīng)。因此，使攜帶治療基因的非病毒載體準(zhǔn)確識(shí)別靶細(xì)胞并在靶細(xì)胞中特異表達(dá)是治療的關(guān)鍵。
　　我們根據(jù)異位內(nèi)膜上特異性的受體，對(duì)納米載體表面進(jìn)行結(jié)構(gòu)上的配體修飾，設(shè)計(jì)一種高度靶向子宮內(nèi)膜異位癥的新型納米載體，并使其介導(dǎo)基因作用于內(nèi)異癥大鼠，考察其對(duì)

5、大鼠內(nèi)異癥的治療作用，同時(shí)探索新型靶向納米載體介導(dǎo)基因治療內(nèi)異癥的安全性和可能機(jī)制，為最終用于臨床治療內(nèi)異癥，改善現(xiàn)有藥物與手術(shù)方案療效不佳的問(wèn)題提供新思路、新方法。
　　第一部分靶向納米給藥系統(tǒng)的制備及其體外性質(zhì)研究
　　目的:
　　篩選并優(yōu)化靶向納米給藥系統(tǒng)。
　　方法:
　　以碳二亞胺法制備殼寡糖-硬脂酸嫁接物(CSO-SA)。采用芘熒光法測(cè)定嫁接物在水中的臨界膠團(tuán)濃度，采用三硝基苯磺酸法測(cè)定氨基取代

6、度。采用質(zhì)粒DNA(PEDF)作為報(bào)告基因，制備CSO-SA/PEDF基因納米給藥系統(tǒng)。透射電子顯微鏡觀察其表面形態(tài)，微粒粒度與表面電位測(cè)定儀測(cè)定CSO-SA/PEDF納米給藥系統(tǒng)粒徑與表面電位，凝膠阻滯分析考察CSO-SA與PEDF間的密接程度，研究CSO-SA/PEDF基因納米給藥系統(tǒng)的生物穩(wěn)定性，MTT法測(cè)定細(xì)胞毒性。
　　結(jié)果:
　　采用化學(xué)嫁接方法，得到CSO-SA，氨基取代度為13％，其在水中的臨界膠團(tuán)濃度為0.

7、025 mg· mL-1。當(dāng)N/P為9.6時(shí)，CSO-SA/PEDF基因納米給藥系統(tǒng)的粒徑為135.6nm，電位為6.4±0.1 mV。透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)CSO-SA/PEDF納米給藥系統(tǒng)大小均勻，呈球形。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞毒性明顯小于脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染效率高。
　　結(jié)論:
　　初步顯示了這種新型的基因載體高效低毒的特性。
　　第二部分靶向納米載體介導(dǎo)PEDF治療子宮內(nèi)膜異位癥的療效及機(jī)制研究
　　目的:

8、　　為了減少子宮內(nèi)膜異位癥藥物治療引起的副作用，改善臨床治療對(duì)策，設(shè)計(jì)研究CSO-SA/PEDF基因納米給藥系統(tǒng)治療子宮內(nèi)膜異位癥的可行性，并初步探索機(jī)制。
　　方法:
　　采用第一部分內(nèi)容制備的CSO-SA/PEDF基因納米給藥系統(tǒng)，尾靜脈注射后考察CSO-SA/PEDF基因納米給藥系統(tǒng)在子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠中的分布情況;經(jīng)CSO-SA/PEDF基因納米給藥系統(tǒng)治療一個(gè)療程后（2周），觀察其對(duì)異位病灶的影響，考察異位病灶

9、細(xì)胞凋亡、微血管密度、VEGF表達(dá)等各項(xiàng)指標(biāo)的變化。電子顯微鏡法觀察CSO-SA/PEDF基因納米給藥系統(tǒng)對(duì)生殖器官是否有不良反應(yīng)。
　　結(jié)果:
　　PEDF由CSO-SA介導(dǎo)后可分布到子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠的異位病灶組織。CSO-SA/PEDF基因納米給藥系統(tǒng)的治療可引起子宮內(nèi)膜異位病灶縮小，使異位子宮內(nèi)膜明顯萎縮，微血管密度明顯降低。CSO-SA/PEDF治療組的子宮內(nèi)膜異位病灶細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加。但CSO-SA/PE

10、DF治療組的子宮和卵巢組織的病理形態(tài)學(xué)未見(jiàn)明顯異常，超微結(jié)構(gòu)觀察亦未見(jiàn)明顯異常。
　　結(jié)論:
　　CSO-SA/PEDF基因納米給藥系統(tǒng)可用作子宮內(nèi)膜異位癥的有效治療方法。
　　第三部分特異性靶向納米載體介導(dǎo)AQP2-siRNA治療子宮內(nèi)膜異位癥的療效及機(jī)制研究
　　目的:
　　為研究新的治療子宮內(nèi)膜異位癥的方法，構(gòu)建特異性靶向納米載體，并研究特異性靶向納米載體介導(dǎo)AQP2-siRNA治療內(nèi)異癥的療效及可能

11、機(jī)制。
　　方法:
　　化學(xué)合成法制備殼寡糖-聚乙烯亞胺復(fù)合物（Polyethyleniminegrafted chitosanoligosaccharide，CSO-PEI）。通過(guò)正負(fù)電吸附原理構(gòu)建AQP2-siRNA基因納米給藥系統(tǒng)，并根據(jù)基因濃度制備不同N/P的基因納米給藥系統(tǒng)。通過(guò)共同孵育的方法物理包裹透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)。凝膠阻滯分析考察陽(yáng)離子嫁接物與AQP2-siRNA的密接程度，研究

12、納米給藥系統(tǒng)的生物穩(wěn)定性。原子力顯微鏡觀察其表面形態(tài)，微粒粒度與表面電位測(cè)定儀測(cè)定(CSO-PEI/siRNA)HA納米給藥系統(tǒng)粒徑與表面電位，MTT法測(cè)定細(xì)胞毒性。熒光嫁接法(FITC)考察細(xì)胞攝取情況，在體熒光顯微鏡法觀察基因納米給藥系統(tǒng)在模型動(dòng)物體內(nèi)的分布。尾靜脈注射(CSO-PEI/siRNA)HA納米給藥系統(tǒng)和生理鹽水，治療一個(gè)療程后觀察其對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥病灶大小的影響和病理學(xué)形態(tài)變化。直觀比較子宮內(nèi)膜異位癥病灶凋亡、內(nèi)異

13、組織CD44表達(dá)情況、微血管密度變化等各項(xiàng)指標(biāo)，分析(CSO-PEI/siRNA)HA對(duì)異位病灶細(xì)胞的促凋亡作用，考察(CSO-PEI/siRNA)HA對(duì)新生血管生成的抑制作用，透射電子顯微鏡法觀察(CSO-PEI/siRNA)HA對(duì)模型大鼠子宮、卵巢等生殖器官臟器是否有不良反應(yīng)。
　　結(jié)果:
　　1.(CSO-PEI/siRNA)HA基因納米給藥系統(tǒng)物理穩(wěn)定性好，形態(tài)分布均勻。
　　2.(CSO-PEI/siRNA)

14、HA基因納米給藥系統(tǒng)細(xì)胞毒性小，攝取能力強(qiáng)。
　　3.(CSO-PEI/siRNA)HA基因納米給藥系統(tǒng)可通過(guò)HA配體特異性靶向內(nèi)異細(xì)胞CD44。
　　4.(CSO-PEI/siRNA)HA基因納米給藥系統(tǒng)在體內(nèi)子宮內(nèi)膜囊腫部位的分布明顯高于對(duì)照組。
　　5.(CSO-PEI/siRNA)HA基因納米給藥系統(tǒng)治療組可使異位病灶大小明顯縮小，異位子宮內(nèi)膜出現(xiàn)明顯的萎縮跡象。
　　6.(CSO-PEI/siRNA)H

15、A基因納米給藥系統(tǒng)治療組的血管密度顯著降低。
　　7.(CSO-PEI/siRNA)HA基因納米給藥系統(tǒng)治療組異位病灶細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于對(duì)照組。
　　8.(CSO-PEI/siRNA)HA基因納米給藥系統(tǒng)治療組對(duì)生殖器官臟器無(wú)明顯不良反應(yīng)。
　　9.內(nèi)異組織中的CD44表達(dá)量明顯高于正常內(nèi)膜組織中的表達(dá);當(dāng)(CSO-PEI/siRNA)HA基因納米給藥系統(tǒng)治療后CD44表達(dá)量明顯降低。
　　結(jié)論:
　　(