甲烷對(duì)缺血再灌注和缺血損傷的治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　缺血再灌注(Ischemia and reperfusion，I/R)損傷是組織缺血后血流恢復(fù)時(shí)導(dǎo)致的一種典型的病理損傷，臨床上常見于肝移植、腦卒中等嚴(yán)重危害人體健康的疾病。缺血性損傷是缺乏血供所導(dǎo)致的組織損傷，如冠狀動(dòng)脈梗塞導(dǎo)致的心肌缺血性損傷等。目前臨床上針對(duì)I/R和缺血損傷都沒有理想的治療手段，研究I/R和缺血損傷尋找治療方法仍然十分必要。氧化損傷、炎癥水平增高、細(xì)胞死亡是I/R和缺血損傷主要的病理生理

2、學(xué)基礎(chǔ)，圍繞這些機(jī)制研究尋找治療手段是許多研究的主要思路。雖然諸多動(dòng)物研究中證實(shí)，針對(duì)致病機(jī)制進(jìn)行的治療，對(duì)再灌注損傷和缺血損傷有較好的療效，但并未能進(jìn)一步應(yīng)用于臨床。
　　甲烷的生物活性一直未被認(rèn)識(shí)清楚，近年來有研究表明，生物機(jī)體正常情況下可以利用甲烷合成有機(jī)物，同時(shí)損傷的組織細(xì)胞自身也會(huì)合成甲烷，更有研究發(fā)現(xiàn)呼吸甲烷可治療小腸I/R損傷。但是考慮到，甲烷治療小腸缺血再灌注損傷的工作仍然不夠全面，甲烷治療I/R損傷作用尚需要進(jìn)一

3、步明確，甲烷對(duì)其他重要器官I/R損傷和缺血性損傷是否具有保護(hù)效應(yīng)也需要研究，甲烷治療I/R和缺血性損傷的機(jī)制也需要深入探討。因此，本研究分別探索甲烷對(duì)肝臟、腦組織I/R損傷和心臟缺血損傷的保護(hù)效應(yīng)并初步探討分子機(jī)制。首先用肝I/R損傷模型確定甲烷對(duì)肝I/R損傷的保護(hù)效應(yīng)，尋找甲烷治療的合適劑量與給藥時(shí)間，從抗炎癥、抗氧化和抗細(xì)胞凋亡等方面進(jìn)一步確認(rèn)甲烷保護(hù)作用途徑，對(duì)這些作用機(jī)制進(jìn)行初步探討;在上述研究基礎(chǔ)上，利用腦缺血再灌注損傷模型，

4、進(jìn)一步確定甲烷對(duì)中樞神經(jīng)損傷的保護(hù)作用，并從細(xì)胞凋亡角度進(jìn)行了機(jī)制的初步探討;利用心臟缺血損傷模型確認(rèn)甲烷對(duì)缺血性損傷的治療作用，進(jìn)一步確認(rèn)甲烷最佳給藥濃度、時(shí)間以及與組織含量之間的關(guān)系，探索甲烷是否通過減少氧化炎癥水平，抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)心肌缺血性損傷。
　　本研究主要分三個(gè)部分:
　　第一部分甲烷治療肝I/R損傷及其機(jī)制研究
　　方法:建立肝I/R損傷模型，缺血60 mins，再灌注6h后檢測，觀察五個(gè)濃度對(duì)肝臟I/

5、R損傷后肝功能指標(biāo)的治療效果，找出甲烷生理鹽水給藥的最佳劑量。甲烷生理鹽水于灌注開始時(shí)立即一次性給予實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的劑量。然后將第二批動(dòng)物隨機(jī)分為三組:假手術(shù)組，I/R損傷組以及I/R后給予10 ml/kg甲烷生理鹽水治療組。檢測肝功能指標(biāo)，炎癥指標(biāo)白介素-1β（IL-1β），白介素6(IL-6)與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，檢測氧化指標(biāo)8-羥基鳥嘌呤(8-OHG)，超氧化物岐化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，檢測細(xì)胞凋亡指標(biāo)Caspas

6、e-3，觀察組織切片HE染色，TUNEL陽性細(xì)胞染色。
　　結(jié)果:劑量為10 ml/kg的甲烷生理鹽水給予后，明顯降低炎癥水平，減弱氧化損傷，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，與I/R損傷模型組比較具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:甲烷生理鹽水是一種可行的給藥方法，腹腔注射10ml/kg劑量可以獲得比較理想的效果，甲烷可通過減少炎癥，氧化損傷與抑制凋亡等途徑發(fā)揮治療肝臟I/R損傷的作用。
　　第二部分甲烷治療腦I/R損傷及其機(jī)制研究<

7、br>　　方法:建立腦I/R損傷模型，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組:假手術(shù)組，腦I/R損傷給予生理鹽水組，腦I/R損傷給予甲烷生理鹽水組。甲烷生理鹽水給予劑量為10ml/kg，于再灌注開始后立即一次性給予。觀察腦梗死體積，行為學(xué)評(píng)分，腦組織切片HE染色，TUNEL陽性細(xì)胞染色，Western Blot檢測caspase-3表達(dá)。
　　結(jié)果:甲烷給藥有效改善動(dòng)物腦I/R損傷后行為學(xué)評(píng)分，減少腦梗死體積，減小HE染色腦組織死亡面積，減少TU

8、NEL陽性細(xì)胞數(shù)目，減少Caspase-3蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)論:甲烷通過抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡對(duì)I/R后腦損傷發(fā)揮治療作用。
　　第三部分甲烷治療心肌缺血損傷及其機(jī)制研究
　　方法:建立心肌缺血模型，第一批動(dòng)物采用多種劑量研究量效曲線。第二批實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組，假手術(shù)組，心肌缺血損傷給予生理鹽水模型組，心肌缺血損傷后給予甲烷生理鹽水治療組，甲烷生理鹽水按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的劑量在左前降支結(jié)扎30 mins后一次性給予，檢測給予

9、甲烷生理鹽水后，血液與心肌組織中甲烷含量。檢測心肌梗死體積，檢測心室重構(gòu)指標(biāo)與射血分?jǐn)?shù)。檢測氧化指標(biāo)SOD，MDA，8-OHG，CD68與MPO，檢測炎癥指標(biāo)IL-1β，IL-6，TNF-α以及黃嘌呤氧化酶，檢測凋亡指標(biāo)caspase-3，活化的caspase-3，caspase-9，活化的caspase-9的蛋白表達(dá)，檢測Bax，Bcl-2蛋白表達(dá)及其比值結(jié)果，檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C，線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C及其比值，檢測Bax，Bcl-2，

10、caspase-3的免疫組化陽性數(shù)目。
　　結(jié)果:甲烷生理鹽水含甲烷濃度穩(wěn)定，給予甲烷生理鹽水后組織中甲烷含量增高。與模型組相比，給予10 ml/kg甲烷生理鹽水后顯著減小心肌梗死體積，減緩心室重構(gòu)進(jìn)程，降低炎癥水平，減弱氧化損傷，抑制caspase-3，caspase-9以及Bax/Bcl-2比值，抑制細(xì)胞色素C的活化與增多。
　　結(jié)論:甲烷生理鹽水可治療心肌缺血損傷，其機(jī)制可能是通過減少氧化炎癥水平，抑制細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的。

11、
　　總結(jié):本課題系列研究通過使用多種模型，提供了大量證據(jù)，證明甲烷生理鹽水具有治療肝臟、腦I/R損傷和心肌缺血損傷的作用。甲烷生理鹽水治療可以改善肝I/R損傷后肝功能;治療腦I/R損傷，保護(hù)腦組織，改善腦功能;改善心肌缺血損傷后心功能并預(yù)防心室重構(gòu)。甲烷生理鹽水的器官保護(hù)作用可能與其抗炎癥反應(yīng)，抗氧化損傷與抑制細(xì)胞凋亡特性有關(guān)。本課題創(chuàng)新性將富含甲烷生理鹽水應(yīng)用于研究，已獲批發(fā)明專利，被其他學(xué)者采納并用于研究，本課題也為臨床缺血