褪黑素對腎缺血再灌注損傷大鼠遠(yuǎn)程器官損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)損傷是一個(gè)全身性的反應(yīng)，某個(gè)器官的I/R損傷可引起其他器官不同程度的損害，即遠(yuǎn)程器官的次級損傷。氧自由基(oxygen free radical，OFR)是外源性氧化劑或細(xì)胞內(nèi)有氧代謝過程中產(chǎn)生的具有很高生物活性的氧分子。生理狀態(tài)下，體內(nèi)產(chǎn)生的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等能迅速清除OFR，防止OFR的堆積。I/R以后，缺血和缺氧的直接結(jié)果是營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏和

2、ATP生成的減少；從而導(dǎo)致OFR的大量產(chǎn)生，當(dāng)超過機(jī)體的清除能力時(shí)，體內(nèi)還原物質(zhì)被消耗，即可直接損傷組織和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 褪黑素(melatonin，MT)是目前發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)最強(qiáng)的抗氧化物質(zhì)之一，能有效清除體內(nèi)OFR。研究證實(shí)，MT對心、腦、肝、小腸和胰腺缺血再灌注損傷均有明顯的保護(hù)作用，而關(guān)于其對I/R后引發(fā)的遠(yuǎn)程器官次級損傷的作用鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在采用生化、免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)等方法觀察褪黑素對腎臟缺血再灌注損傷(ren

3、al ischemia reperfusion injure，RIRI)引發(fā)的遠(yuǎn)程器官次級損傷的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。 第一部分 MT對RIRI大鼠心肌OFR和細(xì)胞凋亡的影響目的：觀察MT對RIRI大鼠心肌的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。 方法：采用夾閉大鼠雙側(cè)腎動(dòng)、靜脈45分鐘后松夾再灌注的方法制作RIRI模型，觀察MT對RIRI大鼠心肌的影響。32只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、缺血再灌注24h組

4、(I/R)、褪黑素組(MT)、陽性對照維生素C組(VC)，每組8只。I/R組、MT組和陽性對照VC組均夾閉雙側(cè)腎動(dòng)、靜脈45分鐘，然后去夾再灌。MT組于夾閉前30分鐘和再灌后30分鐘腹腔注射MT 10 mg/kg，VC組于夾閉前30分鐘和再灌后30分鐘分別腹腔注射VC 125mg/kg，IR組則同法給予等量生理鹽水。再灌注后逐層縫合腹膜、腹壁肌肉和皮膚。Sham組除不夾閉雙側(cè)腎動(dòng)、靜脈外，余手術(shù)操作同前三組。再灌注24小時(shí)后取腹主動(dòng)脈血

5、，測定血清肌酐(Scr)、血清尿素氮(SUN)，取血后迅速摘取心臟，測定心肌組織MDA含量、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和SOD活性，留取相同部位組織標(biāo)本做病理形態(tài)學(xué)觀察(HE染色)，并測定心肌細(xì)胞凋亡率(流式細(xì)胞分析技術(shù))以及Bcl-2和Bax的表達(dá)(免疫組織化學(xué))。 結(jié)果：RIRI導(dǎo)致腎臟、心肌明顯損傷，表現(xiàn)為： 1.與Sham組相比，I/R組Scr、SUN及心肌組織MDA含量均明顯增加(P＜0.01)，L

6、DH和CK活性明顯增強(qiáng)(P＜0.01)， SOD活性則明顯減弱(P＜0.01)；與I/R組相比，MT組Scr、SUN及心肌組織MDA含量均明顯降低(尸＜0.01)，LDH和CK活性明顯減弱(P＜0.01，P＜0.05)，而SOD活性明顯增強(qiáng)(P＜0.05)； MT組與VC組比較無明顯差異。 2.I/R組腎小管上皮細(xì)胞明顯受損，以近曲小管為重，表現(xiàn)為腎小管管腔擴(kuò)張，管內(nèi)可見管型和脫落細(xì)胞，上皮細(xì)胞核染色質(zhì)邊集，胞漿空泡變性、壞死，

7、心肌組織可見有少量凋亡細(xì)胞及炎性浸潤；MT組及VC組腎小管損傷范圍和程度均明顯小于和輕于I/R組，腎小管上皮細(xì)胞核基本正常，管內(nèi)僅見少量管型，心肌未見明顯病理改變。 3.I/R組的心肌細(xì)胞凋亡率(20.76±2.02％)明顯高于sham組(2.66±0.53％)(P＜0.01)，MT組、VC組的心肌細(xì)胞凋亡率分別為(13.40±0.96％)、(13.49±1.51％)，明顯低于I/R組(P＜0.01)。 4 sham組B

8、cl-2與Bax蛋白表達(dá)較少，I/R組Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)增多，與I/R組相比，MT及VC組Bax蛋白表達(dá)減少，而。Bcl-2蛋白表達(dá)增加。 結(jié)論：MT對RIRI大鼠心肌有一定的保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能與其清除氧自由基，上調(diào)Bcl-2表達(dá)、下調(diào)Bax表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。 第二部分MT對RIRI大鼠腦組織OFR、NO和細(xì)胞凋亡的影響目的：觀察MT對RIRI大鼠腦組織的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。 方法

9、：模型制備和實(shí)驗(yàn)方法同第一部分。各組采用硝酸還原酶法測定組織NO，并測定組織iNOS活力。 結(jié)果：RIRI導(dǎo)致腎臟、腦組織明顯損傷，表現(xiàn)為： 1與Sham組相比，I/R組Scr、SUN、腦組織MDA、NO含量均明顯增加(P＜0.01)，iNOS活性明顯升高(P＜0.01)，SOD活性則明顯降低(P＜0.01)；與I/R組相比，MT組Scr、SUN、腦組織MDA、NO含量均明顯降低(P＜0.01)，iNOS活性明顯降低(P

10、＜0.05)，而SOD活性明顯升高(P＜0.05)：MT組與VC組比較無明顯差別。 2I/R組腎小管上皮細(xì)胞明顯受損，以近曲小管為重，表現(xiàn)為腎小管管腔擴(kuò)張，管內(nèi)可見管型和脫落細(xì)胞，上皮細(xì)胞核染色質(zhì)邊集，胞漿空泡變性、壞死；MT組及VC組腎小管損傷范圍和程度均明顯小于和輕于I/R組，腎小管上皮細(xì)胞核基本正常，管內(nèi)僅見少量管型。I/R組神經(jīng)細(xì)胞間隙增寬，部分退變的神經(jīng)元呈凋亡特征，細(xì)胞皺縮成圓形或卵圓形，核染色質(zhì)固縮、邊集；MT及VC組神經(jīng)

11、細(xì)胞較I/R組有明顯改善。 3I/R組的神經(jīng)細(xì)胞凋亡率(23.53±3.13％)明顯高于sham組(3.24±0.71％)(P＜0.01)，MT、VC組的細(xì)胞凋亡率分別為(13.81±2.01％)、(14.20±1.51％)，明顯低于I/R組(P＜0.01)。 4 sham組Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)較少，I/R組Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)增多，與I/R組相比MT及VC組Bax蛋白表達(dá)減少，而Bcl-2蛋白表達(dá)增加。