香煙煙霧對雄性小鼠生殖能力的影響及男性不育的相關(guān)生物信息學(xué)研究.pdf

1、目的:不孕不育影響了全世界近10％-15％的夫婦，已成為社會公共的健康問題。其中，男性因素約占不孕癥病例的40％-50％，并且這個數(shù)字仍在不斷增加。幾十年來，香煙煙霧誘導(dǎo)男性不育的相關(guān)研究一直受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。然而，其確切的機制尚不明確。課題組前期通過構(gòu)建男性吸煙者與非吸煙者的450甲基化表達芯片，篩選出差異甲基化表達基因-外周致密纖維1(ODF1)，并通過焦磷酸測序進一步證實了ODF1在吸煙者精子中的高甲基化表達。接下來，本研究將

2、通過體外模擬被動吸煙環(huán)境，構(gòu)建吸煙小鼠模型，從精子發(fā)生水平探討香煙煙霧對成年雄性小鼠睪丸組織形態(tài)、精子活率、睪丸組織ODF1基因和蛋白表達的影響，從而探討香煙煙霧對雄性小鼠生殖能力影響的作用機理。此外，通過生物信息學(xué)分析，探討ODF1基因在男性不育樣本中的表達和進一步分析男性不育差異基因的表達譜，探討男性不育的發(fā)生機理。
　　方法:
　　1、構(gòu)建吸煙小鼠模型:選取6-8周齡的C57BL/6J健康雄性小鼠，參照前人的研究方法體

3、外模擬被動吸煙環(huán)境，分別給予小鼠香煙煙霧暴露處理2周、4周和6周，ELISA試劑盒檢測血清中可替寧的含量，驗證吸煙小鼠模型的成功構(gòu)建。
　　2、實驗驗證:(1) HE染色觀察吸煙小鼠睪丸組織形態(tài)的改變;(2)血球計數(shù)板計數(shù)小鼠精子活率;(3)免疫組織化學(xué)方法觀察吸煙小鼠睪丸組織ODF1蛋白改變情況;(4)實時熒光定量PCR技術(shù)檢測吸煙小鼠睪丸組織ODF1mRNA表達水平的改變。
　　3、生物信息學(xué)分析:(1)應(yīng)用GEO2R工

4、具對男性不育患者中ODF1基因進行差異表達分析;(2)基于R/Bioconductor/DAVID進行男性不育差異基因表達譜分析。
　　結(jié)果:
　　1、健康成年雄性小鼠經(jīng)過2周、4周和6周的香煙煙霧處理后，血清的可替寧含量明顯高于不吸煙組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。吸煙6周后，小鼠血清的可替寧含量己達吸煙者水平，為(10.76±2.19) ng/ml，提示吸煙小鼠模型的成功構(gòu)建;
　　2、香煙煙霧處理的小鼠睪丸組織生精上皮受

5、損，出現(xiàn)生精細胞的缺失及生殖細胞的凋亡;
　　3、香煙煙霧處理6周的小鼠睪丸組織ODF1mRNA表達量明顯低于對照組;
　　4、經(jīng)過香煙煙霧處理后，小鼠精子活率沒有發(fā)生顯著改變;
　　5、在“GSE6872”和“GSE45885”數(shù)據(jù)集中，相比正常生育男性，ODF1基因在畸形精子癥和非梗阻性無精子癥患者中為低表達狀態(tài)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、本實驗成功建立吸煙小鼠模型，可為后續(xù)的研究及其他疾