Fos-Jun連接的AFP-HLA-A2二聚體的制備及其構象穩(wěn)定性的分析.pdf

1、HLA-A2是一種經(jīng)典的MHC I類分子，含兩條多肽鏈：重鏈（H鏈或α鏈,包括α1、α2和α3結構域）與輕鏈（L鏈或β2m鏈），其中β2m非共價結合于α3結構域?？乖慕Y合于由α1、α2形成的抗原結合槽，當抗原肽與MHC分子結合形成pMHC，可被APC呈遞給CD8+T細胞表面的TCR識別，引起特異性細胞免疫應答。α鏈、β2m鏈和抗原肽三者的穩(wěn)定結合，對維持MHCⅠ類分子天然構象及發(fā)揮生物功能具有重要的意義。因此，我們將抗原肽、α鏈、β2

2、m鏈穩(wěn)定連接，以期獲得不易解離的pMHC復合物，保證其結構與功能的完整。研究證實pMHC單體與TCR的親和力較低，不能有效的激活CTL，于是后期研究通過將pMHC多聚化來提高抗原與TCR的親和力，并發(fā)現(xiàn)可溶性pMHC二聚體可與TCR高親和力結合。
　　前期研究表明，非共價連接的HLA-A2二聚體，具有檢測與調節(jié)CTL的功能。由于非共價連接具有可逆性，不能耐受SPA純化的酸性環(huán)境，故本室曾通過兩個柔性連接肽(G4S)3將AFP抗原肽

3、、β2m鏈與α鏈三者共價連接，并在CHO細胞中表達出共價連接的AFP/HLA-A2二聚體，但是該二聚體經(jīng)SPA純化后，其構象仍會改變而影響生物學活性。故本課題靈活采用共價與非共價連接方式，首先將AFP抗原肽通過(G4S)3共價連接至β2m鏈，再通過轉錄因子Fos和Jun形成的亮氨酸拉鏈結構將AFP-(G4S)3-β2m鏈以疏水結合作用非共價連接至α鏈，使抗原肽穩(wěn)定加載至融合的HLA-A2/IgG1-Fc單體上，兩個pMHC單體借助Fc段

4、的鏈間二硫鍵連接形成Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體，以便后續(xù)可經(jīng)SPA純化得到純度較高的正確構象二聚體，旨在提高pMHC二聚體與TCR的親和力，從而高效擴增pMHC特異性的同種反應性T細胞。本研究主要內容與結果如下：
　　一、Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體的制備
　　為了構建pFastBacTMDual＋［AFP-(G4S)3-β2m-Jun］+［HLA-A2-Fos/IgG1-Fc］表達質粒

5、，選用本室保存的具有P10和Ph兩個啟動子的pFastBacTMDual空質粒為載體，將擴增所獲的基因片段分別插入該載體兩側啟動子下游。以本室前期構建的質粒pFastBacTMDual+［DR15/IgG1-Fc］為模板，分別擴增出轉錄因子Fos和Jun序列以及IgG1-Fc基因；以Invitrogen公司合成的pMD19-T+AFP-(G4S)3-β2m質粒作為模板，擴增出AFP-(G4S)3-β2m基因片段；應用人HLA-A2特異性

6、引物從T2細胞中擴增HLA-A2(α1-α3)。再通過重疊PCR方法，分別將AFP-(G4S)3-β2m與Jun和HLA-A2與Fos基因片段連接。最后通過酶切位點將AFP-(G4S)3-β2m-Jun融合基因插入P10啟動子下游，將HLA-A2-Fos、IgG1-Fc融合基因依次插入Ph啟動子下游，獲得目的質粒pFastBacTMDual＋［AFP-(G4S)3-β2m-Jun］+［HLA-A2-Fos/IgG1-Fc］。經(jīng)過特異性引

7、物對各基因片段的PCR鑒定、限制性內切酶的酶切鑒定和堿基序列測定均證實目的基因按照正確的順序完全插入了質粒。
　　pFastBacTMDual＋［AFP-(G4S)3-β2m-Jun］+［HLA-A2-Fos/IgG1-Fc］重組質粒在大腸桿菌 DH10BacTM輔助質粒轉座酶的作用下，轉化入桿狀病毒穿梭質粒，形成Bacmid+［AFP-(G4S)3-β2m-Jun］+［HLA-A2-Fos/IgG1-Fc］,將 PCR鑒定正確的

8、重組Bacmid DNA轉染至昆蟲細胞SF9中，在轉染成功的細胞上清中即可表達Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體。收獲此上清，其中含成熟病毒顆粒，繼續(xù)感染正常SF9細胞，用構像依賴性抗體W6/32進行ELISA檢測每一代上清中Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體的構象與分泌水平，結果證實獲得了正確構像的融合蛋白，且感染后第五代的SF9上清中Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體表達量最高。大量收集感染第五代

9、病毒的SF9上清，通過Western-Blot鑒定由Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2單體的分子量約77KD，與預期相符。最后通過 FITC-BB7.2抗體流式細胞術檢測，結果示 Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體與HLA-A2陰性個體的單核細胞有一定的結合率。
　　二、Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體與共價連接的AFP/HLA-A2二聚體的構象穩(wěn)定性分析
　　雖然Fos-Jun連接的AFP/

10、HLA-A2二聚體與共價連接的AFP/HLA-A2二聚體都含有IgG1-Fc片段，理論上都可用金黃色葡萄球菌蛋白A（SPA）進行純化。但前期實驗發(fā)現(xiàn)共價連接的AFP/HLA-A2二聚體在洗脫液（pH3.0的0.1M甘氨酸）的酸性環(huán)境中易發(fā)生β2m脫落，破壞其完整結構。為了解決SPA純化導致構象嚴重丟失的問題，本試驗采用不易受pH等環(huán)境影響的亮氨酸拉鏈結構將AFP-(G4S)3-β2m和α鏈連接，并通過BEVS表達出Fos-Jun連接的A

11、FP/HLA-A2二聚體。將Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體與共價連接的AFP/HLA-A2二聚體經(jīng)SPA純化后的構象變化做對比，發(fā)現(xiàn)大部分共價連接的AFP/HLA-A2二聚體中β2m脫落，導致該二聚體構象缺失（構象完整率：12.3％±3.26%，n=3）；而大部分Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體卻可保持構像的完整（構象完整率：71.24%±12.1%,n=3）。說明在酸性環(huán)境中，F(xiàn)os-Jun形成的亮氨酸拉