可溶性人鼠嵌合HLA-A2二聚體的構(gòu)建、表達(dá)與鑒定.pdf

1、T細(xì)胞通過(guò)其表面的TCR與細(xì)胞表達(dá)的抗原肽/MHC復(fù)合物（pMHC）相結(jié)合而發(fā)揮識(shí)別抗原的作用，T細(xì)胞的應(yīng)答可在一定程度上被可溶性pMHC分子抑制。pMHC二聚體是由二個(gè)pMHC分子通過(guò)抗體Fc段的鏈間二硫鍵連接而形成的pMHC多聚體形式之一。對(duì)比單體pMHC分子，pMHC二聚體與TCR特異性結(jié)合的親和力更高。而人類同種異體移植排斥反應(yīng)是受者T細(xì)胞的TCR識(shí)別移植物細(xì)胞的同種異型pMHC分子引發(fā)的特異性T細(xì)胞應(yīng)答，理論上能夠被可溶性同種

2、異型pMHC分子抑制。
　　因此，擬選擇用僅有一個(gè)MHC座位不相配的轉(zhuǎn)基因小鼠分別作為移植的供、受者，即表達(dá)HLA-A2的轉(zhuǎn)基因小鼠（NOD來(lái)源）作為供者，而表達(dá)HLA-A24的轉(zhuǎn)基因小鼠（NOD來(lái)源）作為受者。通過(guò)利用同種T細(xì)胞和可溶性pMHC二聚體之間的特異性結(jié)合，誘導(dǎo)移植物特異性的T細(xì)胞耐受。由于供者小鼠表達(dá)的是人鼠嵌合HLA-A2分子，本研究?jī)?nèi)容即構(gòu)建、表達(dá)和鑒定這種可溶性人鼠嵌合HLA-A2二聚體，為在上述小鼠移植模型中

3、使用可溶性pMHC二聚體誘導(dǎo)移植物特異性的T細(xì)胞耐受提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。主要內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.克隆人鼠嵌合HLA-A2基因：HLA-A2轉(zhuǎn)基因NOD小鼠基因的重鏈和輕鏈基因是共價(jià)連接的一條鏈，包括人β2m、α1、α2和小鼠α3的嵌合基因。提取該轉(zhuǎn)基因小鼠mRNA，使用特異性引物通過(guò)RT-PCR技術(shù)從中克隆出人鼠嵌合HLA-A2段基因，經(jīng)過(guò)電泳鑒定其基因片段大小、藍(lán)白斑篩選重組子、并測(cè)序比對(duì)與目的基因序列一致，證實(shí)成功克隆出的人鼠

4、嵌合HLA-A2段基因。
　　2.構(gòu)建人鼠嵌合HLA-A2二聚體的真核表達(dá)載體：將人鼠嵌合基因HLA-A2段與含有小鼠IgG2bFc段基因的重組質(zhì)粒pcDNA3.1+IgG2bFc連接，構(gòu)建表達(dá)HLA-A2與小鼠IgG2bFc段融合蛋白的重組質(zhì)粒pcDNA3.1+HLA-A2/IgG2bFc，經(jīng)過(guò)PCR鑒定、酶切鑒定基因片段分子量以及基因測(cè)序比對(duì)目的基因顯示無(wú)突變基因，證明該重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　3.在小鼠細(xì)胞系中表達(dá)人鼠

5、嵌合HLA-A2二聚體：將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)入小鼠J558L細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)G418篩選，RT-PCR檢測(cè)出HLA-A2基因片段證實(shí)重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入J558L細(xì)胞。收集成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清用羊抗鼠IgG抗體和兔抗人β2m抗體進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果表達(dá)的融合蛋白能與羊抗鼠IgG抗體和兔抗人β2m抗體結(jié)合，證實(shí)該轉(zhuǎn)染細(xì)胞能表達(dá)目的蛋白人鼠嵌合HLA-A2二聚體，之后選取ELISA結(jié)果中目的蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞進(jìn)行單克隆化篩選。

6、r>　　4.人鼠嵌合HLA-A2二聚體的構(gòu)象鑒定：通過(guò)PEG濃縮單克隆化轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清后，得到可溶性人鼠嵌合HLA-A2二聚體濃縮產(chǎn)物，采用HLA-A2構(gòu)象特異性的抗體BB7.2通過(guò)微球流式技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞所表達(dá)的人鼠嵌合HLA-A2二聚體進(jìn)行構(gòu)象鑒定，顯示出二聚體能高親和力的與BB7.2抗體結(jié)合證實(shí)所表達(dá)的融合蛋白具有正確的HLA-A2構(gòu)象。
　　本研究構(gòu)建和表達(dá)了可溶性人鼠嵌合HLA-A2二聚體，并且鑒定其具有正確的HLA-A2構(gòu)