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1、神經(jīng)元凋亡在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,而且越來(lái)越多的證據(jù)表明神經(jīng)元凋亡是形成神經(jīng)退行性疾病的機(jī)制之一。因此,闡明神經(jīng)元凋亡機(jī)制對(duì)于發(fā)現(xiàn)神經(jīng)性疾病病因和明確治療靶點(diǎn)有非常重要的意義。 小腦顆粒神經(jīng)元(CGNs)是哺乳動(dòng)物腦中豐富的中樞神經(jīng)元。體外培養(yǎng)CGNs時(shí),胞外25mM KCl(高鉀)可使神經(jīng)元處于去極化狀態(tài),維持小腦顆粒神經(jīng)元的分化、成熟和存活,而去血清、復(fù)極化濃度的KCl(5mM,低鉀)培養(yǎng)基可誘導(dǎo)分化成熟的
2、小腦顆粒神經(jīng)元凋亡。由于小腦顆粒神經(jīng)元來(lái)源豐富、體外培養(yǎng)的同質(zhì)性高,所以此凋亡模型已被廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)元凋亡機(jī)制的研究。 大量研究表明,JNK/c-Jun通路的激活在神經(jīng)元凋亡過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。低鉀處理小腦顆粒神經(jīng)元、撤NGF處理的交感神經(jīng)元、D淀粉樣蛋白處理大腦皮質(zhì)神經(jīng)元等凋亡模型中,都已證明JNK的活化是凋亡發(fā)生所必需的。c-Jun與ATF2作為JNK重要的下游底物,其活性也伴隨磷酸化水平的升高而升高,目前的研究表明,
3、c-Jun與ATF2可以形成轉(zhuǎn)錄因子二聚體作用于下游的靶基因,從而發(fā)揮促凋亡作用。 c-jun作為AP1蛋白家族需要與其它bZIP結(jié)構(gòu)蛋白形成二聚體才能發(fā)揮完整的轉(zhuǎn)錄因子功能,而且一直以來(lái)圍繞著凋亡下游的靶基因是什么,尤其是c.iun這個(gè)與凋亡關(guān)系比較密切的轉(zhuǎn)錄因子的靶基因是什么的問(wèn)題是近幾年國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。然而在低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡中,c-Jun與ATF2是否形成了二聚體并沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)予以直接回答,而二者與凋亡之間的
4、關(guān)系也沒(méi)有明確的報(bào)道。如果我們能證實(shí)在低鉀誘導(dǎo)的CGNs凋亡中,c-Jun/ATF2二聚體確實(shí)形成并參與了凋亡進(jìn)程,那么對(duì)于以c-Jun/ATF2轉(zhuǎn)錄因子二聚體為出發(fā)點(diǎn)來(lái)尋找下游靶基因具有重要的指導(dǎo)意義。因此,本課題主要探討以下幾個(gè)問(wèn)題: 1.在低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí),c-Jun與ATF2活性是否增加; 2.在低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí),c-Jun與ATF2是否形成了二聚體; 3.c-Jun與ATF2
5、二聚體的形成是否是神經(jīng)元凋亡所必須的。 結(jié)果 1.低鉀(5mM KCl)誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型時(shí)c-Jun與ATF2的活性變化小腦顆粒神經(jīng)元體外培養(yǎng)第7天,分別用25mM KCl(25K)或5mM KCl(5K)培養(yǎng)基處理0.5、1、2、4h。收集蛋白后用Western Blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),低鉀處理時(shí),ATF2的69與71位蘇氨酸磷酸化水平從0.5h開(kāi)始增加,2h達(dá)到峰值,然后逐漸下降,而ATF2的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng),是
6、69/71位蘇氨酸磷酸化依賴(lài)的;同時(shí)我們用c-Jun磷酸化抗體(Ser73)檢測(cè)c-Jun磷酸化水平的變化,發(fā)現(xiàn)c-Jun磷酸化水平在低鉀0.5h后同樣顯著增加,2h達(dá)到最高,c-Jun Ser63,Ser73位點(diǎn)的磷酸化同樣能增加c-Jun轉(zhuǎn)錄活性。這說(shuō)明神經(jīng)元凋亡時(shí),c-Jun與ATF2的磷酸化水平增加,轉(zhuǎn)錄活性增加。 2.低鉀(5mM KCl)誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型時(shí)c-Jun與ATF2形成二聚體c-Jun與ATF2同
7、屬于堿性-亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZip)蛋白成員,已有的研究表明,c-Jun與ATF2可以形成二聚體并且特異性與ATF/CRE序列(TTACCTCA或TGACGTCA,下稱(chēng)ATF序列)結(jié)合。為此,我們用ATF序列為探針進(jìn)行了EMSA分析,以獲得低鉀誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)c-Jun與ATF2形成二聚體的證據(jù)。體外培養(yǎng)第7天的神經(jīng)元分別用25K、5K處理4h,然后收集核蛋白,與γ<'32>p標(biāo)記的ATF探
8、針?lè)跤笈苣z,干膠后放射自顯影。發(fā)現(xiàn)ATF探針與核蛋白形成復(fù)合物,并且此復(fù)合物在5 K處理增加。進(jìn)一步超飄移實(shí)驗(yàn)(supershift assay)來(lái)證明復(fù)合物中的組分。探針核蛋白孵育時(shí)加入c-Jun抗體,發(fā)現(xiàn)ATF位點(diǎn)特異復(fù)合物明顯減少,而在上方出現(xiàn)了一新條帶(supershifted band),表明c-Jun為復(fù)合物組分之一。加入ATF2抗體后發(fā)現(xiàn),特異條件減弱,顯示ATF2抗體可干預(yù)特異復(fù)合物的形成,表明ATF2也存在蛋白復(fù)合物
9、中。我們的結(jié)果顯示c-Jun與ATF2都存在結(jié)合ATF位點(diǎn)的蛋白質(zhì)復(fù)合物中,強(qiáng)烈提示兩者作互作用形成復(fù)合體。 3.小分子干擾c-Jun或ATF2對(duì)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡和存活的干預(yù)作用體外培養(yǎng)第5天的小腦顆粒神經(jīng)元,用鈣磷沉淀法共轉(zhuǎn)染shc-Jun-a,shc-Jun-b或空質(zhì)粒BS/U6,pEGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染用于標(biāo)記轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。48h后,換成25K、5K模型。12h后Hoechst 33258(5 g/ml)進(jìn)行染色顯示細(xì)胞
10、核形態(tài)用于計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞(細(xì)胞核固縮或細(xì)胞核碎裂),GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)為總數(shù),計(jì)算凋亡率。結(jié)果顯示干擾c-Jun表達(dá)后神經(jīng)元凋亡率大大下降,同樣的沉默ATF2也具有保護(hù)性干預(yù)作用。 4.P12×jun2 decoy質(zhì)粒對(duì)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡和存活的干預(yù)作用體外培養(yǎng)第5天的小腦顆粒神經(jīng)元,用鈣磷沉淀法共轉(zhuǎn)染P12×jun2,P12×jun2-mut或空質(zhì)粒pMD,pEGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染用于標(biāo)記轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。36h后,換成25K、5K模
11、型。12h后Hoechst 33258(5 ug/ml)進(jìn)行染色顯示細(xì)胞核形態(tài)用于計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞(細(xì)胞核固縮或細(xì)胞核碎裂),GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)為總數(shù),計(jì)算凋亡率。結(jié)果顯示P12×jun2組顯著的降低5K下的神經(jīng)元凋亡率,說(shuō)明P12×jun2decoy質(zhì)粒能有效的保護(hù)低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡。 結(jié)論: 1.在低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí),c-Jun與ATF2轉(zhuǎn)錄活性增加。 2.轉(zhuǎn)錄因子c-Jun與ATF2在低鉀
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