c-Jun-ATF2二聚體在神經(jīng)元凋亡中的作用.pdf

1、神經(jīng)元凋亡在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，而且越來越多的證據(jù)表明神經(jīng)元凋亡是形成神經(jīng)退行性疾病的機制之一。因此，闡明神經(jīng)元凋亡機制對于發(fā)現(xiàn)神經(jīng)性疾病病因和明確治療靶點有非常重要的意義。 小腦顆粒神經(jīng)元(CGNs)是哺乳動物腦中豐富的中樞神經(jīng)元。體外培養(yǎng)CGNs時，胞外25mM KCl(高鉀)可使神經(jīng)元處于去極化狀態(tài)，維持小腦顆粒神經(jīng)元的分化、成熟和存活，而去血清、復極化濃度的KCl(5mM，低鉀)培養(yǎng)基可誘導分化成熟的

2、小腦顆粒神經(jīng)元凋亡。由于小腦顆粒神經(jīng)元來源豐富、體外培養(yǎng)的同質(zhì)性高，所以此凋亡模型已被廣泛應用于中樞神經(jīng)元凋亡機制的研究。 大量研究表明，JNK/c-Jun通路的激活在神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮了重要作用。低鉀處理小腦顆粒神經(jīng)元、撤NGF處理的交感神經(jīng)元、D淀粉樣蛋白處理大腦皮質(zhì)神經(jīng)元等凋亡模型中，都已證明JNK的活化是凋亡發(fā)生所必需的。c-Jun與ATF2作為JNK重要的下游底物，其活性也伴隨磷酸化水平的升高而升高，目前的研究表明，

3、c-Jun與ATF2可以形成轉錄因子二聚體作用于下游的靶基因，從而發(fā)揮促凋亡作用。 c-jun作為AP1蛋白家族需要與其它bZIP結構蛋白形成二聚體才能發(fā)揮完整的轉錄因子功能，而且一直以來圍繞著凋亡下游的靶基因是什么，尤其是c．iun這個與凋亡關系比較密切的轉錄因子的靶基因是什么的問題是近幾年國內(nèi)外研究的熱點。然而在低鉀誘導的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡中，c-Jun與ATF2是否形成了二聚體并沒有相關文獻予以直接回答，而二者與凋亡之間的

4、關系也沒有明確的報道。如果我們能證實在低鉀誘導的CGNs凋亡中，c-Jun/ATF2二聚體確實形成并參與了凋亡進程，那么對于以c-Jun/ATF2轉錄因子二聚體為出發(fā)點來尋找下游靶基因具有重要的指導意義。因此，本課題主要探討以下幾個問題： 1．在低鉀誘導的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時，c-Jun與ATF2活性是否增加； 2．在低鉀誘導的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時，c-Jun與ATF2是否形成了二聚體； 3．c-Jun與ATF2

5、二聚體的形成是否是神經(jīng)元凋亡所必須的。 結果 1．低鉀(5mM KCl)誘導小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型時c-Jun與ATF2的活性變化小腦顆粒神經(jīng)元體外培養(yǎng)第7天，分別用25mM KCl(25K)或5mM KCl(5K)培養(yǎng)基處理0.5、1、2、4h。收集蛋白后用Western Blot方法檢測發(fā)現(xiàn)，低鉀處理時，ATF2的69與71位蘇氨酸磷酸化水平從0.5h開始增加，2h達到峰值，然后逐漸下降，而ATF2的轉錄活性增強，是

6、69/71位蘇氨酸磷酸化依賴的；同時我們用c-Jun磷酸化抗體(Ser73)檢測c-Jun磷酸化水平的變化，發(fā)現(xiàn)c-Jun磷酸化水平在低鉀0.5h后同樣顯著增加，2h達到最高，c-Jun Ser63，Ser73位點的磷酸化同樣能增加c-Jun轉錄活性。這說明神經(jīng)元凋亡時，c-Jun與ATF2的磷酸化水平增加，轉錄活性增加。 2．低鉀(5mM KCl)誘導小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型時c-Jun與ATF2形成二聚體c-Jun與ATF2同

7、屬于堿性-亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper，bZip)蛋白成員，已有的研究表明，c-Jun與ATF2可以形成二聚體并且特異性與ATF/CRE序列(TTACCTCA或TGACGTCA，下稱ATF序列)結合。為此，我們用ATF序列為探針進行了EMSA分析，以獲得低鉀誘導小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時c-Jun與ATF2形成二聚體的證據(jù)。體外培養(yǎng)第7天的神經(jīng)元分別用25K、5K處理4h，然后收集核蛋白，與γ<'32>p標記的ATF探

8、針孵育后跑膠，干膠后放射自顯影。發(fā)現(xiàn)ATF探針與核蛋白形成復合物，并且此復合物在5 K處理增加。進一步超飄移實驗(supershift assay)來證明復合物中的組分。探針核蛋白孵育時加入c-Jun抗體，發(fā)現(xiàn)ATF位點特異復合物明顯減少，而在上方出現(xiàn)了一新條帶(supershifted band)，表明c-Jun為復合物組分之一。加入ATF2抗體后發(fā)現(xiàn)，特異條件減弱，顯示ATF2抗體可干預特異復合物的形成，表明ATF2也存在蛋白復合物

9、中。我們的結果顯示c-Jun與ATF2都存在結合ATF位點的蛋白質(zhì)復合物中，強烈提示兩者作互作用形成復合體。 3．小分子干擾c-Jun或ATF2對小腦顆粒神經(jīng)元凋亡和存活的干預作用體外培養(yǎng)第5天的小腦顆粒神經(jīng)元，用鈣磷沉淀法共轉染shc-Jun-a，shc-Jun-b或空質(zhì)粒BS/U6，pEGFP質(zhì)粒共轉染用于標記轉染成功的細胞。48h后，換成25K、5K模型。12h后Hoechst 33258(5 g/ml)進行染色顯示細胞

10、核形態(tài)用于計數(shù)凋亡細胞(細胞核固縮或細胞核碎裂)，GFP陽性細胞數(shù)計為總數(shù)，計算凋亡率。結果顯示干擾c-Jun表達后神經(jīng)元凋亡率大大下降，同樣的沉默ATF2也具有保護性干預作用。 4．P12×jun2 decoy質(zhì)粒對小腦顆粒神經(jīng)元凋亡和存活的干預作用體外培養(yǎng)第5天的小腦顆粒神經(jīng)元，用鈣磷沉淀法共轉染P12×jun2，P12×jun2-mut或空質(zhì)粒pMD，pEGFP質(zhì)粒共轉染用于標記轉染成功的細胞。36h后，換成25K、5K模

11、型。12h后Hoechst 33258(5 ug/ml)進行染色顯示細胞核形態(tài)用于計數(shù)凋亡細胞(細胞核固縮或細胞核碎裂)，GFP陽性細胞數(shù)計為總數(shù)，計算凋亡率。結果顯示P12×jun2組顯著的降低5K下的神經(jīng)元凋亡率，說明P12×jun2decoy質(zhì)粒能有效的保護低鉀誘導的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡。 結論： 1．在低鉀誘導的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時，c-Jun與ATF2轉錄活性增加。 2．轉錄因子c-Jun與ATF2在低鉀