P65在持續(xù)性術后痛中的作用.pdf

1、背景與目的
　　持續(xù)性術后痛是發(fā)生在一些常見的外科手術比如開胸術，腹股溝疝修補術，剖宮產術等手術后，發(fā)生率為4-13％，持續(xù)時間在3-30個月不等。持續(xù)性術后痛是一個重要的臨床問題，嚴重降低了病人的生活質量，其發(fā)生機制還不明確。目前，離子通道受體在疼痛中的作用越來越受到重視，比如鉀離子通道受體、鈉離子通道受體等。鈉離子受體的其中一個亞型Nav1.7主要表達在周圍神經系統(tǒng)脊髓背根神經節(jié)神經元中，負責傷害性信號的傳入，參與了多種類型的

2、疼痛通路進程，但是在持續(xù)性術后痛中的作用機制不清楚。NF-κB是表達在多種類型的細胞中的重要的核轉錄因子，活化后的NF-κB進入細胞核內通過與目標基因的啟動子區(qū)結合參與多種基因的調控，p65是 NF-κB的一個常見的亞型,并且在疼痛的發(fā)生發(fā)展中參與了對多種炎癥介質的調控。本研究旨在探討p65,Nav1.7在持續(xù)性術后痛中的作用，以及在持續(xù)性術后痛模型中p65是否參與對Nav1.7的調控。
　　實驗方法
　　首先，我們通過We

3、stern blot和免疫熒光染色檢測了模型大鼠同側L4-6 DRG中Nav1.7和p-p65（p65磷酸化）的表達，然后鞘內注射ProTx-II（Nav1.7阻斷劑）或PDTC（p65抑制劑），檢測Nav1.7蛋白的表達和機械撤足閾值的變化，最后使用免疫共沉淀技術檢測p-p65是否可以與Nav1.7基因啟動子區(qū)結合。通過GraphPad Prism5.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　實驗結果
　　1 SMIR（皮膚肌

4、肉切口牽拉）模型誘導了大鼠術側足底的機械性痛覺過敏
　　incision組和naive組相比，機械撤足閾值沒有統(tǒng)計學意義；與incision組相比，SMIR組術側的機械撤足閾值在術后5天開始下降，直到術后20天；而對側的機械撤足閾值，SMIR組和incision組相比沒有統(tǒng)計學意義；三組之間的熱縮足潛伏期沒有統(tǒng)計學差異。
　　2 DRG（脊髓背根神經節(jié)）中的 Nav1.7參與了 SMIR模型介導的機械性痛覺過敏
　　W

5、estern blot檢測結果顯示，與術前大鼠相比，術后10天，15天，20天，大鼠術側L4-6 DRG Nav1.7的表達量明顯增高。為了確認是否上調的Nav1.7在SMIR介導的痛覺過敏中起作用，我們通過鞘內注射Nav1.7阻斷劑ProTx-II，發(fā)現(xiàn)ProTx-II可以有效的緩解SMIR模型介導的機械性痛覺過敏。
　　3 Nav1.7主要表達在CGRP、IB4、NF-200標記的陽性細胞上
　　為了確認 Nav1.7在

6、 DRG神經元中的表達類型，我們使用了免疫熒光雙染的方法，發(fā)現(xiàn)Nav1.7與CGRP、IB4、NF-200標記的細胞共標，通過Imagej軟件分析，發(fā)現(xiàn)80%的Nav1.7陽性細胞是小直徑神經元，17%的Nav1.7陽性細胞是中直徑神經元，僅有3%的Nav1.7陽性細胞是大直徑神經元。
　　4 P-p65在SMIR模型DRG中高表達
　　有研究報道，p-p65參與了神經病理性疼痛和炎性疼痛的進程。本研究中我們檢測了DRG中p

7、-p65在SMIR模型介導的持續(xù)性術后痛中的作用。我們發(fā)現(xiàn)PDTC可以阻止 SMIR模型大鼠的機械性痛覺過敏。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)與incision組相比，SMIR模型大鼠術側L4-6 DRG中的核蛋白p-p65在術后10天、15天高表達，而PDTC預處理可以逆轉p-p65的高表達。
　　5 P-p65通過上調大鼠DRG中Nav1.7的表達參與了SMIR模型介導的持續(xù)性術后痛
　　我們知道，p65是一種很重要的核

8、轉錄因子，參與了多種目的基因的轉錄。為了進一步驗證p-p65是否在持續(xù)性術后痛中參與了對Nav1.7的調控，我們通過鞘內注射PDTC來檢測Nav1.7的表達變化，結果顯示，在術后10天和15天， PDTC可以阻止Nav1.7的上調。接著我們做了免疫熒光雙染，發(fā)現(xiàn)p-p65與CGRP, NF-200和 IB-4共表達。免疫共沉淀結果顯示，p-p65在引物2,7,8,9可以與SCN9A基因啟動子區(qū)結合。
　　結論
　　p-p65