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文檔簡介
1、本文主要從以下幾部分進行論述:
研究內容一 125例中國馬凡綜合征患者致病基因突變篩查
馬凡綜合征(Marfan syndrome,MFS)是一種常染色體顯性遺傳的結締組織病,在人群中發(fā)病頻率為1/3000-1/5000。通過高通量測序對MFS相關基因FBN1、TGFBR1、TGFBR2進行檢測,是對患者進行明確診斷,指導手術及藥物治療的有效手段。
目的:繪制中國MFS人群突變譜;進行中國MFS基因型表型關
2、聯(lián)分析;為中國MFS患者提供明確診斷、指導治療、預后評估及遺傳咨詢;對未篩查到致病變異的家系進行全外顯子組測序(WES)以期發(fā)現(xiàn)新的可能致病基因。
方法:1.研究對象:125例中國MFS患者及家系成員;2.研究方法:(1)高通量二代測序:通過Ion torrent測序平臺對125例患者進行靶基因測序,測序Panel(靶基因引物庫)中包含3個明確的MFS致病基因;對二代測序結果進行篩選;并對所篩選到的結果進行Sanger測序驗證
3、;(2)家系分析:對通過Ion torrentPGM測序未發(fā)現(xiàn)疑似致病變異的有家族史的患者進行了STR marker家系連鎖分析,確定連鎖區(qū)域。對致病基因連鎖在FBN1基因的家系,進行FBN1基因重測序或整個FBN1基因測序;對于FBN1基因不連鎖的家系,進行全外顯子組測序分析,以期發(fā)現(xiàn)新的致病基因。對一個類馬凡的雙胞胎家系進行全外顯子組測序分析。(3)MLPA檢測大片段插入/缺失突變:對未發(fā)現(xiàn)致病變異患者進行多重連接依賴式探針擴增技術
4、(MLPA)檢測患者是否攜帶FBN1基因DNA大片段的插入/缺失突變;通過定量PCR的方法對MLPA結果進行驗證,并且通過步移法來縮短斷裂點上下游的序列;Long Range PCR(長片段PCR)進行擴增和測序,確定具體斷裂點;提取FBN1基因48-53號外顯子缺失的患者血管組織RNA,進行轉錄水平分析;(4)對高通量測序篩選和MLPA檢測到的變異進行基因型表型關聯(lián)性分析。
結果:1.高通量測序結果:在125例患者中,96例
5、患者發(fā)現(xiàn)100個疑似的致病變異,其中55個為新突變(55.0%);97個(97.0%)疑似的致病變異位于FBN1基因,2個(2.0%)位于TGFBR1基因,1個(1.0%)位于TGFBR2基因;所有變異中包含有34個(34.0%)半胱氨酸的錯義突變;21個(21.0%)非半胱氨酸錯義突變;11個(11.0%)剪接位點突變;11個(11.0%)移碼突變和15個(15.0%)無義突變;攜帶兩個疑似致病變異的患者:發(fā)現(xiàn)3例患者攜帶兩個疑似的致
6、病變異;對家系成員測序分析,發(fā)現(xiàn)其中1例患者為復合雜合,而另2例為的兩個致病變異發(fā)生在同一等位基因;2.家系研究:在一個家系中發(fā)現(xiàn)FBN1基因附近marker與疾病表型連鎖,通過對FBN1基因重測序發(fā)現(xiàn)41號外顯子發(fā)生移碼插入突變;與FBN1不連鎖家系,經(jīng)過醫(yī)學外顯子組基因高通量測序,發(fā)現(xiàn)位于SMAD3基因突變;發(fā)現(xiàn)CKB基因為雙胞胎家系候選致病基因。3.基因組重排檢測結果:通過MLPA檢測,共發(fā)現(xiàn)有4例患者分別攜帶有FBN1基因的6號
7、,48-53號,49-50號和1-36號外顯子的大片段缺失,通過長片段PCR(Long Range PCR)進行長片段擴增和測序,確定該4例患者分別缺失了16,551 bp,10,346bp,4,563 bp和187,067 bp;通過分析患者血管組織mRNA水平發(fā)現(xiàn)缺失的48-53號為非移碼缺失缺失,其后的mRNA在體內保持穩(wěn)定不被降解,由此推測6號和49-50號外顯子缺失可能也為非移碼缺失。而1-36號外顯子缺失突變范圍包含F(xiàn)BN1
8、基因上游11.5kb,使缺失的等位基因不能正常轉錄翻譯。4.基因型表型相關性分析:發(fā)現(xiàn)攜帶半胱氨酸錯義突變的患者和攜帶剪接位點突變的患者與攜帶截短突變的患者相比,更容易患晶狀體脫位,兩例色氨酸突變?yōu)榫彼岬幕颊呤?。心血管方面,攜帶截短(PTC)突變的患者相較于剪接位點突變的患者更容易患主動脈夾層。攜帶FBN1基因p.C123G變異患者表現(xiàn)為罕見的頸總動脈夾層。5.結合以往研究報道對大片段缺失的患者進行基因型—表型分析發(fā)現(xiàn),大片段非移碼
9、缺失突變患者表型取決于缺失位置及片段大小,但傾向于嚴重新生兒型MFS。大片段缺失(FBN1)引起單倍劑量不足導致的MFS,癥狀多表現(xiàn)為經(jīng)典的MFS癥狀。
結論:1.本研究通過PGM測序技術,檢測到中國MFS人群中103個疑似的致病突變,其中有55個為新突變,豐富了MFS的基因突變譜;2.攜帶FBN1基因剪接位點突變和半胱氨酸錯義突變的患者相對于攜帶PTC的患者更傾向于患晶狀體脫位;而PTC變異導致的患者,更傾向于患主動脈夾層;
10、攜帶FBN1基因PTC突變的患者與攜帶TGFBR1/2基因突變的患者表型類似,均表現(xiàn)為不易患晶狀體異位,易患主動脈夾層。提示MFS患者眼部異常與原纖維蛋白-1結構變化相關,主動脈夾層與TGFβ信號通路改變相關。3.MLPA是檢測MFS大片段缺失/重復的有效手段,攜帶非移碼缺失突變的患者傾向于表現(xiàn)為新生兒MFS,單倍劑量不足引起的MFS多表現(xiàn)為經(jīng)典型;4.復合雜合變異也能夠導致MFS,對馬凡綜合征的產(chǎn)前篩查具有重要提示作用。
研
11、究內容二 成人支氣管擴張致病基因篩查及病因學研究
支氣管擴張(Bronchiectasis,簡稱支擴)是一種常見的氣道炎癥疾病,因反復氣道感染和炎癥造成支氣管和細支氣管管腔異常擴張,關于該病尤其是非囊性纖維化支氣管擴張(non-CF bronchiectasis,NCFB)的病因、發(fā)病機制及疾病進展過程等的相關研究國內仍較匱乏。支氣管擴張是一種異質性很強的疾病,目前對該病的治療手段有限,嚴重影響著患者的生活質量。目前對支氣管擴
12、張的病因學評估分類研究僅能解釋約50%的患者?;颊叩牟∫驅W明確有助于患者的管理,改善患者治療方法以及鞏固長期療效。
目的:研究中國成人支氣管擴張患者病因組成。從遺傳學角度揭示支氣管擴張患者的遺傳易感性,為支氣管擴張患者病因學分類提供新的標準。
方法:1.研究對象:知情同意基礎上收集192例中國成人支氣管擴張患者以及100例確診無肺部疾病的正常對照個體外周血;2.研究方法:(1)192例支氣管擴張患者的病因學分類;(2
13、)高通量測序:通過Ion torrent PGM測序平臺對192例支擴患者以及100例正常個體進行靶基因Panel測序;測序完成后數(shù)據(jù)通過wANNOVAR網(wǎng)站注釋VCF格式的原始文件;對二代測序結果進行常規(guī)篩選,保留可能致病的變異位點;通過致病性軟件對變異位點進行致病性判斷;對所篩選到的結果進行Sanger測序驗證,根據(jù)變異類型進行分類統(tǒng)計;(3)對192例患者及100例正常對照進行CFTR基因8號內含子區(qū)域(TG)m Tn重復序列的P
14、CR擴增,使用ABI3730型號的DNA測序分析儀器測序后分析(TG)m Tn重復次數(shù);(4)分析CFTR基因雙等位基因突變和CFTR/ENaC基因雙重雜合變異,以及分析CFTR基因V470M多態(tài);篩選囊性纖維化(PCD)相關致病基因的純合變異,復合雜合突變;比較192例患者與100例正常個體的PCD相關致病基因的突變頻率。(4)基因型—表型分析,統(tǒng)計攜帶DNAH5,DNAH11雙等位基因突變和CFTR/ENaC雙重雜合變異的患者的表型
15、,比較各個基因突變導致的患者的支氣管擴張嚴重程度綜合評分(BSI值)。(5)對發(fā)現(xiàn)致病變異的患者進行病因學統(tǒng)計,并統(tǒng)計遺傳因素在支氣管擴張發(fā)病中所占的比例。
結果:(1)本研究對中國成人支氣管擴張患者人群進行了病因學分類,發(fā)現(xiàn)31.8%患者為特發(fā)性,27.6%的患者為感染后發(fā)病,13.0%的患者為免疫缺陷,4.2%的患者為哮喘,3.1%的患者為胃食管反流,其他類型為8.3%。(2)通過CFTR基因和上皮鈉離子轉運蛋白基因(EN
16、aC)的基因篩查,共發(fā)現(xiàn)3例患者攜帶位于CFTR基因的復合雜合突變,其中1例患者為IVS85T(TGmT5)純合變異攜帶者;另外發(fā)現(xiàn)2例患者攜帶CFTR/ENaC基因雙重雜合突變;CFTR基因V470M多態(tài),在純合M470/M470背景下,發(fā)現(xiàn)12例患者攜帶CFTR基因致病變異,正常對照組為1例,支擴組顯著多于正常對照組(6.3%vs.1.0%,P=0.039);(3) PCD相關基因突變篩查:發(fā)現(xiàn)20例患者攜帶PCD相關基因雙等位基因
17、突變(10.4%,20/192),其中14例攜帶DNAH11基因雙等位基因突變,4例攜帶DNAH5基因復合雜合突變,1例攜帶CCDC40基因復合雜合突變,1例攜帶HEATR2純合突變。并且發(fā)現(xiàn)1例攜帶位于X染色體的RPGR基因突變;在100例正常個體中發(fā)現(xiàn)有3例攜帶位于DNAH11基因的雙突變。(4)基因型—表型關聯(lián)性分析:發(fā)現(xiàn)攜帶有DNAH5基因突變的患者相比攜帶DNAH11基因突變患者,其表型要嚴重(BSI平均值:8.8 vs.4.
18、2);攜帶CFTR/ENaC基因雙重雜合子的患者癥狀表型要比攜帶CFTR基因復合雜合的患者癥狀嚴重(CFTR/ENaC BSI=10Vs CFTR/CFTR BSI=5.2)。(5)共有26例患者發(fā)現(xiàn)攜帶可能致病的致病變異,占到患者總人數(shù)的13.54%。這些患者中16例病因學為特發(fā)性,5例為結核感染后發(fā)病,2例為反流,1例為lgG1免疫缺陷,1例為哮喘和1例麻疹感染后發(fā)病。
結論:本研究對中國成人支氣管擴張患者人群進行了病因學
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