α-N-乙酰半乳糖胺酶突變文庫(kù)的建立及篩選.pdf

1、α-N-乙酰半乳糖胺酶是血型轉(zhuǎn)換的工具酶，可以降解A型紅細(xì)胞表面抗原、消除其抗原抗體反應(yīng)，在輸血治療中，可以避免血型配型帶來(lái)的不便。本實(shí)驗(yàn)室從報(bào)道的α-N-乙酰半乳糖胺酶中選取活性最好的酶，構(gòu)建α-N-乙酰半乳糖胺酶的原核表達(dá)載體，表達(dá)并純化α-N-乙酰半乳糖胺酶，檢測(cè)酶活性。利用定點(diǎn)突變技術(shù)，在關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變，用高通量篩選技術(shù)篩選突變文庫(kù)，期望得到較高活性的α-N-乙酰半乳糖胺酶。本課題的研究工作主要包括以下兩部分：
　　

2、1.α-N-乙酰半乳糖胺酶的構(gòu)建
　　 為了建立新型α-N-乙酰半乳糖胺酶的篩選、檢測(cè)方法，我們提取腦膜金黃桿菌的基因組DNA，以此為模板PCR擴(kuò)增出α-N-乙酰半乳糖胺酶(A4)。將A4克隆至pET-24a載體，轉(zhuǎn)化B121表達(dá)菌株進(jìn)行蛋白表達(dá)。使用親和層析方法純化His-A4酶，選擇顯色底物驗(yàn)證酶活性。同時(shí)，我們改進(jìn)了傳統(tǒng)的ELISA方法，直接將紅細(xì)胞膜包被于ELISA檢測(cè)平板中，以紅細(xì)胞膜表面抗原作為直接底物，用ELISA

3、方法檢測(cè)酶活性。此研究建立了新型ELISA實(shí)驗(yàn)方法，以此方法驗(yàn)證了A4酶的活性，證明了此酶能夠有效降低紅細(xì)胞表面抗原抗體反應(yīng)，且具有濃度和時(shí)間依賴性。
　　 2.α-N-乙酰半乳糖胺酶突變文庫(kù)的篩選
　　 自然界中的α-N-乙酰半乳糖胺酶活性較低，不足以大規(guī)模生產(chǎn)酶用于通用型血的制備。在本實(shí)驗(yàn)中，使用定點(diǎn)突變技術(shù)結(jié)合高通量篩選方法，期望得到活性較高的糖苷酶。我們突變了酶的6個(gè)氨基酸位點(diǎn)分別是96、98、179、181、2