新型重組工程負篩選標記的建立和N-乙酰-D-神經氨酸酶催化菌株的優(yōu)化.pdf

1、重組是同源重組介導的基因工程，通過生物體內誘導產生的同源重組酶進行，是一種高效的適用于體內遺傳工程的方法，不受連接酶和限制性核酸內切酶的限制，可以在任何位點實現(xiàn)DNA分子的重組修飾，在基因敲除、點突變等方面有廣泛的應用，具有操作簡單、快速高效等優(yōu)點。
　　負篩選標記是針對作為正選擇標記的抗生素抗性基因而言的，含有此基因時不能存活的一種基因類型，廣泛運用于基因克隆和DNA修飾。本論文提出了一種新型重組工程介導的誘導型ccdB基因的負

2、篩選方法，據(jù)報道，與galK、thyA、sacB、tolC等負篩選標記相比，來源于F質粒、作用于DNA拓樸異構酶Ⅱ而呈現(xiàn)毒性的ccdB基因篩選效率最為高效。
　　在實驗中，我們選擇抗生素抗性基因和誘導型ccdB基因聯(lián)合使用，plac啟動子置于ccdB之前使得在IPTG誘導下表達ccdB，誘導型ccdB基因作為負篩選標記，只需要加入誘導劑便可得到篩選，還可以實現(xiàn)對不具有耐受CcdB毒性蛋白的菌株的修飾。以大腸桿菌DH10B基因組上l

3、acZ基因的敲除為例說明，通過PCR引入50bp的同源臂，構建HA l-aacCl-plac-ccdB-HA2的基因盒，與目的基因發(fā)生同源重組，在慶大霉素抗性篩選之下獲得含有誘導型ccdB基因的突變菌株，然后利用ccdB作為篩選標記，成功獲得含有mKan、bla*目的菌株和無痕敲除的菌株。在誘導型ccdB基因的篩選下，分別將pir116基因和重組酶基因成功敲入到DH10B的lacZ區(qū)域，pir116基因能有容納R6K復制子的質粒，并且使

4、其呈現(xiàn)高拷貝，不再僅僅局限于BUN20作為宿主菌。重組酶基因存在于突變菌株的基因組上，直接加入L-阿拉伯糖誘導重組酶表達，實現(xiàn)線性DNA片段間的同源重組，或實現(xiàn)線性DNA與環(huán)狀質粒的同源重組，操作簡單高效。將I-SceI基因成功敲入到MG1655的uidA區(qū)域，重組效率達到67.5％，I-SceI酶能夠介導雙鏈斷裂修復，相對于質粒水平，將I-SceI基因敲入到基因組水平上比在質粒水平上更加穩(wěn)定的存在與表達，對同源重組中抗性篩選標記的敲除

5、具有重大意義。
　　N-乙酰-D-神經氨酸(Neu5Ac)以及其衍生物是非常重要的生物分子，這些糖分子往往處于大分子物質的末端，具有重要的生物學功能和醫(yī)用價值。在合成Neu5Ac的方法中，全細胞催化法合成Neu5Ac的方法因其具有操作簡單，成本低，環(huán)保等優(yōu)點而廣受歡迎。實驗中在菌株LS2802的基礎上，利用Red重組工程對菌株進行優(yōu)化，將降低胞內GlcNAc的有關基因nagABE、manXYZ、fucIK成功敲除，阻斷代謝途徑，將