炎癥因子和益生菌在潰瘍性結腸炎癌變中的作用與相關機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 炎癥因子在潰瘍性結腸炎癌變中的作用機制初探
　　目的:比較氧化偶氮甲烷(AOM)聯(lián)合葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的潰瘍性結腸炎(UC)癌變動物模型的不同建立方法，并在此動物模型中探討炎癥因子NF-κB、TNF-α在UC癌變中的作用機制。
　　方法:首先，比較UC癌變小鼠模型的建立方法，將C57BL/6小鼠隨機分為4組，第1組為AOM+3輪DSS組:AOM12.5mg/kg腹腔

2、注射，1周后給予第一輪2.5％DSS的飲用水，連續(xù)5天，之后換成普通飲用水，每隔3周重復給予一次DSS，共給3輪;第2組為AOM+1輪DSS組:同第一組給予AOM腹腔注射后，僅給予第一輪DSS飲用;第3組為生理鹽水+3輪DSS組:生理鹽水腹腔注射后，同第1組給予3輪DSS飲用;第4組為空白對照組。以上4組均12周后處死小鼠，統(tǒng)計瘤負荷(TL)和死亡率，進行病理學評估。然后，在AOM/DSS小鼠模型中探討NF-κB、TNF-α在UC癌變中

3、的作用機制，C57BL/6小鼠隨機分為6組，1-5組采用上述方法建立AOM/DSS誘導的UC癌變小鼠模型，第1組給予NF-κB反義寡聚核苷酸每兩周一次灌腸;第2組給予TNF-α單克隆抗體每兩周一次腹腔注射;第3組給予等量生理鹽水灌腸;第4組給予等量生理鹽水腹腔注射;第5組為模型對照組，僅建立AOM/DSS小鼠模型，不予干預;第6組為空白對照組。12周后處死小鼠，統(tǒng)計瘤負荷，進行病理學評估，采用ELISA方法檢測結腸組織TNF-α、IL-

4、6水平，EMSA檢測NF-κB活化程度，免疫組化檢測β-catenin細胞核內(nèi)分布，EMSA檢測TCF-4轉(zhuǎn)錄活性。
　　結果:不同小鼠建模比較發(fā)現(xiàn)，AOM+3輪DSS組(n=11)和AOM+1輪DSS組(n=14)的成瘤率均為100％，但AOM+1輪DSS組小鼠的死亡率低，因此采用AOM+1輪DSS作為UC癌變小鼠模型的建立方法。NF-κB反義寡聚核苷酸組(n=8)的瘤負荷（0.92±0.17cm）較灌腸模型對照組（n=12，T

5、L=2.07±0.33cm）顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);EMSA證實NF-κB反義寡聚核苷酸灌腸后可抑制NF-κB的活化;NF-κB反義寡聚核苷酸組的炎癥因子TNF-α和IL-6水平顯著低于模型對照組(p＜0.05);TNF-α單克隆抗體組(n=9)的瘤負荷（1.45±0.27cm）較腹腔注射模型對照組（n=12，TL=2.20±0.34cm）有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);ELISA證實TNF-α單克隆

6、抗體組的結腸組織TNF-α水平較模型對照組顯著下降(p＜0.05)，且IL-6水平顯著下降(p＜0.05);TNF-α單克隆抗體組的NF-κB活化程度下降;NF-κB反義寡聚核苷酸組和TNF-α單克隆抗體組的小鼠結腸上皮細胞核中的β-catenin水平均顯著下降(p＜0.05)，TCF-4的轉(zhuǎn)錄活性下降，Wnt途徑下調(diào)。
　　結論:AOM腹腔注射后1輪DSS處理是建立UC癌變小鼠模型的較好方法;炎癥因子TNF-α、IL-6在AOM

7、/DSS誘導的UC癌變的小鼠模型中發(fā)揮著重要作用，NF-κB反義寡聚核苷酸和TNF-α單克隆抗體通過抑制NF-κB活性，下調(diào)Wnt/β-catenin途徑，抑制UC癌變的發(fā)生。
　　第二部分 益生菌對潰瘍性結腸炎癌變的抑制作用及相關機制初探
　　目的:探索益生菌及5-氨基水楊酸（5-ASA）對AOM/DSS誘導的UC癌變小鼠模型的干預作用及相關機制。
　　方法:C57BL/6小鼠隨機分為7組，第1-6組建立AOM/DS

8、S誘導的UC癌變小鼠模型，腹腔注射AOM12.5mg/kg，1周后給予含2.5％DSS的飲用水，連續(xù)5天，之后換成普通飲用水，12周后建模完成。第1組為5-ASA組，給予5-ASA75mg/kg/d每日灌胃;第2組為布拉氏酵母菌組，給予布拉氏酵母菌5×107CFU/d每日灌胃;第3組為VSL＃3組，給予VSL#31.5×109CFU/d每日灌胃;第4組為5-ASA+布拉氏酵母菌組，給予上述劑量5-ASA+布拉氏酵母菌每日灌胃;第5組為5

9、-ASA+VSL#3組，給予上述劑量5-ASA+VSL#3每日灌胃;第6組為模型對照組，僅建立AOM/DSS小鼠模型，不予干預;第7組為空白對照組。12周后處死小鼠，統(tǒng)計瘤負荷(TL)，進行病理學評估，采用ELISA方法檢測結腸組織TNF-α、IL-6、IL-10水平，EMSA檢測NF-κB活化程度，免疫組化檢測β-catenin細胞核內(nèi)分布，EMSA檢測TCF-4轉(zhuǎn)錄活性。
　　結果:(1)各組的瘤負荷顯示:5-ASA組(n=2

10、0，TL=0.43±0.14cm)、布拉氏酵母菌組（n=19，TL=0.20±0.07cm）、VSL#3組(n=20，TL=0.25±0.07cm)、5-ASA+布拉氏酵母菌組（n=20，TL=0.53±0.11cm）、5ASA+VSL#3組（n=19，TL=0.46±0.11cm）較模型對照組(n=19，TL=0.97±0.19cm)均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。(2)小鼠結腸組織炎癥因子水平測定發(fā)現(xiàn):5-ASA組、布

11、拉氏酵母菌組、VSL#3組、5-ASA+布拉氏酵母菌組、5ASA+VSL#3組的TNF-α和IL-6水平均較模型對照組明顯下降，IL-10水平較模型對照組明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。(3)EMSA檢測NF-κB轉(zhuǎn)錄活性顯示:5-ASA組、布拉氏酵母菌組、VSL#3組、5-ASA+布拉氏酵母菌組、5ASA+VSL#3組的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性均較模型對照組下降。(4)小鼠結腸組織β-catenin免疫組化顯示:5-ASA組、布

12、拉氏酵母菌組、VSL#3組、5-ASA+布拉氏酵母菌組、5-ASA+VSL#3組結腸上皮細胞中β-catenin的細胞核表達量較模型對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。(5)EMSA檢測TCF-4轉(zhuǎn)錄活性顯示:5-ASA組、布拉氏酵母菌組、VSL#3組、5-ASA+布拉氏酵母菌組、5ASA+VSL#3組的TCF-4轉(zhuǎn)錄活性均較模型對照組下降。
　　結論:益生菌和5-ASA可以抑制AOM/DSS誘導的UC癌變小鼠的結腸