T細(xì)胞受體變化對(duì)慢乙肝抗病毒治療結(jié)局的影響.pdf

1、急性乙型肝炎患者中HBV特異性CD4+及CD8+T細(xì)胞通過其表面的T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別多個(gè)病毒抗原表位，產(chǎn)生多克隆的強(qiáng)效免疫應(yīng)答，控制HBV感染;而在慢性乙型肝炎(CHB)患者的HBV特異性T細(xì)胞功能耗竭。核苷（酸）類似物(NUC)抗病毒治療降低病毒載量及HBV抗原水平，T細(xì)胞功能得到短暫性部分恢復(fù)。但研究方法局限于組織相容性抗原-肽染色、細(xì)胞因子檢測(cè)等方法。而CHB患者其TCR基因表達(dá)變化與抗病毒治療結(jié)局的關(guān)系仍未明確。
　

2、　研究目的：
　　該研究采用無偏差的5'端cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)擴(kuò)增TCRβ鏈(TRB)片段以及高通量測(cè)序，深度分析發(fā)生乙肝e抗原(HBeAg)血清學(xué)轉(zhuǎn)換與否的CHB患者在抗病毒治療早期其外周血CD4+及CD8+T細(xì)胞TRB CDR3的差異;并分析TRB CDR3動(dòng)態(tài)變化與治療期間HBV DNA以及HBV抗原水平的相關(guān)關(guān)系。
　　研究方法：
　　1.研究對(duì)象
　　所有研究對(duì)象來源于一項(xiàng)替比夫定治療臨

3、床隊(duì)列的22例HBeAg陽(yáng)性CHB患者。收集治療0、12、24、52、104周血清及外周抗凝血。根據(jù)治療52周及104周的應(yīng)答情況分為完全應(yīng)答組(CR，n=10)及非完全應(yīng)答組(NCR，n=12)。CR組定義為治療52周及104周HBeAg發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換及HBV DNA水平＜300copies/mL;NCR組定義為治療52周及104周HBeAg維持陽(yáng)性及HBV DNA水平＞300copies/mL;
　　2.分離治療基線、12周、

4、24周外周血單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分選CD4+及CD8+T細(xì)胞，提取總RNA;5'RACE技術(shù)及巢式PCR擴(kuò)增TRB鏈基因全長(zhǎng);構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)及Illumina Hiseq上機(jī)測(cè)序;
　　3.測(cè)序數(shù)據(jù)處理及分析
　　采用免疫組庫(kù)分析軟件MiXCR進(jìn)行V、D、J基因片段比對(duì)，識(shí)別出有效TRB及CDR3序列。相同CDR3序列稱為一種克隆型。根據(jù)兩兩時(shí)間點(diǎn)每種克隆型頻率變化，分為消失、下降、持續(xù)、增生及新增5類克隆型。
　　研

5、究結(jié)果：
　　1.CHB患者抗病毒治療過程中外周血TRB文庫(kù)多樣性分析
　　CR組在治療過程中其CD4細(xì)胞TCR文庫(kù)多樣性比NCR組低，尤其在12周（VDJ組合數(shù)量，P=0.035;CDR3氨基酸克隆型數(shù)量，P=0.03;Shannon指數(shù)值，P=0.041）;而CR組CD8細(xì)胞TCR文庫(kù)多樣性比NCR組高，尤其在基線（CDR3氨基酸克隆型數(shù)量，P=0.041）?？v向分析發(fā)現(xiàn)，無論CD4或CD8細(xì)胞，CHB患者TRB文庫(kù)多樣

6、性在治療基線至12周均呈下降趨勢(shì)，而在CR組患者，尤其在CR組的CD4克隆中（Shannon指數(shù)，P=0.022）更為顯著。
　　2.抗病毒治療過程中TRB CDR3克隆動(dòng)態(tài)變化
　　通過分析基線、治療12周及24周兩兩時(shí)間點(diǎn)克隆型的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在CD4+及CD8+T細(xì)胞中，CR組持續(xù)克隆型比例顯著低于NCR組(P＜0.001);CR組新增與增生克隆型比例顯著高于NCR組，尤其在基線與治療12周期間(P=0.021)。CR

7、組新增與增生CD4克隆型的累積頻率低于NCR組，在CD8亞群中兩組無差異，提示CR組患者的CD4+以及CD8+T細(xì)胞存在多克隆增生，但每種克隆型增生個(gè)數(shù)較NCR組受限。
　　3.HBV血清學(xué)指標(biāo)水平與T細(xì)胞克隆動(dòng)態(tài)變化的相關(guān)分析
　　治療12周時(shí)CHB患者乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBeAg及HBV DNA水平與CD4、CD8持續(xù)克隆型比例呈正相關(guān)關(guān)系;與新增及增生克隆型比例呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(Spearman correl

8、ation，P＜0.05)。治療12周較基線時(shí)HBeAg水平下降幅度與CD4、CD8持續(xù)克隆型比例呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;與新增及增生克隆型比例呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論：
　　在抗病毒治療早期T細(xì)胞針對(duì)多表位的強(qiáng)效克隆增生與CHB患者發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換、HBV抗原及病毒載量下降相關(guān)。NUC治療早期T細(xì)胞克隆的動(dòng)態(tài)變化對(duì)CHB患者T細(xì)胞應(yīng)答重建具有重要作用。將來，NUC聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)治療的策略，如過繼性回輸含有針