C57BL-6J小鼠白色脂肪與棕色脂肪組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的:
　　建立正常C57BL/6J小鼠白色脂肪和棕色脂肪組織蛋白質(zhì)表達(dá)譜;利用高脂飲食誘導(dǎo)肥胖C57BL/6J小鼠模型，探討肥胖小鼠白色脂肪和棕色脂肪組織蛋白質(zhì)表達(dá)變化;通過對(duì)肥胖小鼠分別給予二甲雙胍和利拉魯肽干預(yù)，探索兩種藥物干預(yù)對(duì)白色脂肪和棕色脂肪蛋白表達(dá)譜的影響及其機(jī)制。
　　方法:
　　6周齡雌性C57BL/6J小鼠高脂喂養(yǎng)22周，建立肥胖小鼠模型。將肥胖小鼠隨機(jī)分為三組，分別為二甲雙胍干預(yù)組(MET，n=1

2、2)、利拉魯肽干預(yù)組(GLP-1，n=12)，肥胖對(duì)照組(HFD，n=12)，此外設(shè)立正常飲食對(duì)照組(NOR，n=10)。藥物干預(yù)8周，監(jiān)測(cè)各組小鼠的攝食量、體重;行胰島素耐量試驗(yàn)、糖耐量試驗(yàn)、高胰島素正常葡萄糖鉗夾試驗(yàn);檢測(cè)血脂、血清瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素水平;測(cè)量性腺周圍白色脂肪組織與肩胛區(qū)棕色脂肪重量;提取脂肪組織蛋白質(zhì)并進(jìn)行酶切，應(yīng)用基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)的非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)技術(shù)，鑒定正常C57BL/6J小鼠白色

3、脂肪和棕色脂肪組織蛋白質(zhì)表達(dá)譜，并對(duì)所鑒定蛋白進(jìn)行定性及定量分析。分別對(duì)白色脂肪表達(dá)蛋白、棕色脂肪表達(dá)蛋白以及二者的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。應(yīng)用同位素標(biāo)記相對(duì)或絕對(duì)定量(iTRAQ)聯(lián)合LC-MS/MS的方法，研究高脂飲食小鼠和正常飲食小鼠白色脂肪組織和棕色脂肪組織差異蛋白的表達(dá)情況，同時(shí)觀察二甲雙胍和利拉魯肽干預(yù)對(duì)肥胖小鼠白色脂肪和棕色脂肪蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)建立正常小鼠白色脂肪和棕色脂肪蛋白質(zhì)

4、組表達(dá)譜。
　　A.應(yīng)用基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)技術(shù)，鑒定正常C57BL/6J小鼠白色脂肪的蛋白數(shù)為5847種，最終定量蛋白數(shù)為5408種;棕色脂肪鑒定的蛋白數(shù)為4706種，最終定量蛋白數(shù)為4260種;其中白色脂肪和棕色脂肪共同表達(dá)蛋白3857種，兩種組織蛋白相對(duì)表達(dá)量作比，比值大于4倍的蛋白為1440種，界定為白色脂肪和棕色脂肪相對(duì)表達(dá)量差異蛋白。
　　B.白色脂肪和棕色脂肪上述定量蛋白通過IPA軟件分析，

5、其中最主要的相關(guān)疾病為腫瘤，最重要的相關(guān)信號(hào)通路為EIF2（真核生物啟動(dòng)因子2）信號(hào)通路。
　　C.白色脂肪和棕色脂肪相對(duì)表達(dá)量差異蛋白最主要的相關(guān)生物功能為炎癥反應(yīng)，且在白色脂肪中蛋白表達(dá)量相對(duì)高;重要的相關(guān)信號(hào)通路為線粒體功能，在棕色脂肪中蛋白表達(dá)量相對(duì)高;此外，二者差異蛋白相對(duì)集中的生物過程為能量產(chǎn)生和脂質(zhì)代謝過程。
　　(2)建立肥胖小鼠模型，二甲雙胍和利拉魯肽干預(yù)對(duì)肥胖小鼠體重、脂肪含量、胰島素敏感性、血糖、血脂及

6、脂肪因子具有不同程度的改善。
　　A.高脂飲食喂養(yǎng)22周后，小鼠體重顯著增加，與正常飲食組相比，是其體重的1.6倍(p=0.000)。MET組給藥第8周平均體重較HFD組顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.033); GLP-1組小鼠在給予利拉魯肽干預(yù)第8周，與HFD組相比，體重下降(p=0.000)。與NOR組相比，HFD組小鼠白色脂肪組織含量（脂肪組織重量/體重*100％）增加(p=0.004)，而利拉魯肽干預(yù)可以減少腹腔白色

7、脂肪組織的含量(p=0.045)，MET組與HFD組腹腔白色脂肪組織含量沒有顯著性差異。與NOR組相比，HFD組棕色脂肪減少具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.024)，而利拉魯肽和二甲雙胍干預(yù)對(duì)棕色脂肪組織的含量沒有顯著性影響。
　　B.高胰島素正常葡萄糖鉗夾試驗(yàn)，利用葡萄糖輸注率(Glucose infusion rate，GIR)評(píng)價(jià)胰島素敏感性。HFD組GIR低于NOR組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.001)，與HFD組相比，二甲雙胍和

8、利拉魯肽干預(yù)后，GIR增加均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.05)，而二甲雙胍與利拉魯肽之間無顯著性差異(p=0.22)。
　　C.高脂飲食顯著升高小鼠甘油三酯和總膽固醇水平，HFD組小鼠TC較NOR組小鼠升高(p=0.000)，HFD組小鼠TG升高(p=0.004)。利拉魯肽干預(yù)后，TC水平下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p=0.02)，而二甲雙胍對(duì)TC的影響沒有顯著性差異(p=0.90)。二甲雙胍與利拉魯肽干預(yù)均可以降低TG水平，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義(p＜0.05)。
　　D.高脂飲食可以顯著性上調(diào)小鼠血清瘦素的水平(p=0.000)，二甲雙胍和利拉魯肽干預(yù)可以下調(diào)血清瘦素的水平(p＜0.05)。與NOR組相比，HFD組脂聯(lián)素水平降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p=0.000)，二甲雙胍干預(yù)與利拉魯肽干預(yù)可以使脂聯(lián)素水平上調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。四組血清抵抗素水平變化無顯著性差異(p=0.349)。
　　(3)應(yīng)用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS，研究HFD組

10、、MET組、GLP-1組小鼠白色脂肪和棕色脂肪蛋白表達(dá)變化。
　　A.白色脂肪組織中共鑒定總蛋白數(shù)4388種，其中可定量蛋白數(shù)為4061種，棕色脂肪組織共鑒定總蛋白數(shù)3486種，其中可定量的蛋白數(shù)為3212種。以NOR組為參照，HFD組、MET組和GLP-1組鑒定出1.5倍以上差異蛋白在白色脂肪中分別為529種、363種和240種，棕色脂肪中鑒定出1.5倍以上差異蛋白分別為727種、240種和217種。
　　B.通過對(duì)差異蛋

11、白的生物功能進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)白色脂肪和棕色脂肪差異蛋白主要集中在脂質(zhì)代謝、分子轉(zhuǎn)運(yùn)、小分子生物化學(xué)、心血管疾病、糖代謝等生物功能。二甲雙胍和利拉魯肽干預(yù)后對(duì)糖代謝、脂代謝等機(jī)體代謝狀態(tài)有一定的改善作用。
　　C.通過對(duì)差異蛋白的信號(hào)通路進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)白色脂肪組織差異蛋白主要集中在EIF2（真核生物啟動(dòng)因子2）信號(hào)通路、LXR/RXR（肝臟X受體/類維生素AX受體）活化通路和急性時(shí)相反應(yīng)等信號(hào)通路。棕色脂肪差異蛋白主要集中在線

12、粒體功能障礙通路、氧化磷酸化通路和EIF2等信號(hào)通路。
　　結(jié)論:
　　1.白色脂肪和棕色脂肪鑒定蛋白最主要的相關(guān)疾病為腫瘤，由此提示，脂肪組織的生物活動(dòng)可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在內(nèi)在聯(lián)系。最重要的相關(guān)信號(hào)通路為EIF2（真核生物啟動(dòng)因子2）信號(hào)通路，該通路在細(xì)胞外生長(zhǎng)因子、激素、促細(xì)胞分裂劑或細(xì)胞因子的刺激下，參與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖、蛋白合成等生物活動(dòng)。
　　2.白色脂肪和棕色脂肪相對(duì)表達(dá)量差異蛋白相關(guān)生物功能分析提示白色

13、脂肪組織中存在更多與炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白;差異蛋白相關(guān)信號(hào)通路分析提示棕色脂肪功能蛋白主要為線粒體蛋白;此外，二者差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析提示白色和棕色脂肪主要在炎癥反應(yīng)、能量產(chǎn)生和脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮作用。
　　3.高脂飲食可能通過EIF2信號(hào)通路促進(jìn)小鼠白色脂肪蛋白合成與細(xì)胞增殖，但對(duì)棕色脂肪沒有顯著作用;它還可以抑制白色脂肪和棕色脂肪的糖代謝和脂肪合成，使脂肪分解代償性增加;同時(shí)，可能通過降低棕色脂肪細(xì)胞自由基清除劑的活性，引起

14、細(xì)胞氧化應(yīng)激，促發(fā)棕色脂肪細(xì)胞凋亡增加，而白色脂肪中未見此反應(yīng);此外，高脂飲食可能通過一定機(jī)制促進(jìn)白色脂肪的“棕色化”。在高脂飲食過程中，小鼠白色脂肪可以出現(xiàn)代償性保護(hù)作用，而棕色脂肪可能較白色脂肪細(xì)胞更易受到氧化應(yīng)激損傷而出現(xiàn)凋亡，從而促進(jìn)肥胖的發(fā)生。
　　4.二甲雙胍和利拉魯肽干預(yù)在對(duì)肥胖小鼠體重及胰島素敏感性改善的同時(shí)，對(duì)小鼠白色脂肪和棕色脂肪中EIF2信號(hào)通路、線粒體功能障礙及脂質(zhì)代謝均有一定的改善作用。二甲雙胍對(duì)白色脂肪