Dicer對小鼠白色脂肪組織棕色化的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察Dicer基因脂肪組織特異性敲除后小鼠內(nèi)臟脂肪占體重的比例變化及內(nèi)臟脂肪棕色化程度,再誘導(dǎo) Dicer基因敲除的內(nèi)臟脂肪前體細(xì)胞向棕色脂肪細(xì)胞分化,探索其可能的分子調(diào)控機(jī)制,從而闡述Dicer基因與小鼠內(nèi)臟白色脂肪棕色化的關(guān)系。
　　方法：1.轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建：實(shí)驗(yàn)中，我們將Dicerflox/flox小鼠與Adiponectin-Cre小鼠雜交，從而得到了Adiponectin-Cre；Dicerflox/flox脂肪

2、組織特異性Dicer基因敲除小鼠。記錄小鼠每周體重增長及食物攝入重量。
　　2.轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)試驗(yàn):測定6周成年小鼠的體重,對實(shí)驗(yàn)組和對照小鼠進(jìn)行糖耐量試驗(yàn)。提取小鼠內(nèi)臟脂肪組織稱重，然后4％多聚甲醛固定，石蠟包埋切片后HE染色，比較實(shí)驗(yàn)組和對照組脂肪細(xì)胞的大小。抽提內(nèi)臟白色脂肪RNA,檢測組織中UCP1（解耦聯(lián)蛋白-1）基因的表達(dá)量。
　　3. Dicer對內(nèi)臟脂肪前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化成棕色脂肪細(xì)胞的調(diào)控作用：
　　從D

3、icerflox/flox小鼠內(nèi)臟脂肪組織內(nèi)提取前體細(xì)胞,通過感染LV-Cre-GFP病毒和LV-GFP病毒,模擬基因敲除后向棕色脂肪細(xì)胞分化的過程。通過油紅染色鑒定脂肪細(xì)胞的形成和觀察脂肪細(xì)胞的形態(tài)；
　　3.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-timeqPCR）技術(shù)檢測棕色脂肪細(xì)胞形成相關(guān)基因、線粒體標(biāo)志基因及產(chǎn)熱基因表達(dá)的變化；應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測細(xì)胞解偶聯(lián)蛋白UCP1的表達(dá)差異。以此來探索Dicer基因?qū)π∈?/p>

4、白色脂肪棕色化影響的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.與對照組小鼠相比，Dicer基因脂肪組織特異性敲除小鼠內(nèi)臟脂肪含量減少(p<0.005)，小鼠糖代謝的能力也增強(qiáng)，兩組結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　2.實(shí)驗(yàn)組小鼠內(nèi)臟脂肪組織中脂肪細(xì)胞體積比對照組小鼠中的體積減?。╬<0.01），其 UCP1基因表達(dá)增加，兩組結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.005）。
　　3. Lentivirus-Cre-GFP病毒感染組

5、細(xì)胞經(jīng)棕色脂肪誘導(dǎo)液誘導(dǎo)成成熟的脂肪細(xì)胞后在形態(tài)上與對照組（Lentivirus-GFP感染組）無明顯差異，油紅染色均顯示有多房脂滴。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與棕色脂肪分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Prdm16、PGC-1α表達(dá)量明顯增高，產(chǎn)熱基因UCP-1和線粒體標(biāo)記基因COX8b、COX4也明顯升高，且實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞UCP-1蛋白水平表達(dá)量高于對照組，兩組數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.005）。
　　結(jié)論：
　　Dicer基因脂肪特異性敲除