穴位埋線對(duì)衰老模型大鼠海馬自噬的影響.pdf

1、目的:
　　從行為學(xué)、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)三個(gè)環(huán)節(jié)，通過觀察大鼠一般狀態(tài)、體重、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、水迷宮定位航行試驗(yàn)及空間探索試驗(yàn)，海馬神經(jīng)元HE染色、海馬神經(jīng)元尼氏染色、海馬神經(jīng)元透射電鏡超微結(jié)構(gòu)，海馬神經(jīng)元mTOR信號(hào)通路中ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 mRNA以及p-mTOR、ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白等指標(biāo)，從自噬角度闡明衰老的機(jī)制及慢性應(yīng)激促進(jìn)衰老的機(jī)理，為延緩衰老提供新的思路和理論依據(jù);基于

2、mTOR信號(hào)通路闡明穴位埋線影響復(fù)合衰老模型大鼠海馬自噬功能的機(jī)制，為中醫(yī)藥延緩衰老的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　按照體重排序，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為組空白對(duì)照、模型一組（D-半乳糖腹腔注射）、模型二組（復(fù)合衰老模型）、穴位埋線組、假埋線組，每組12只。
　　空白對(duì)照組僅給予6周腹腔注射生理鹽水。模型一組僅給予6周腹腔注射D-半乳糖（120mg/Kg/d）。模型二組給予6周腹腔注射D

3、-半乳糖（120mg/Kg/d），同時(shí)從第3周開始給予慢性應(yīng)激，共應(yīng)激4周。穴位埋線組給予6周腹腔注射D-半乳糖(120mg/Kg/d)，同時(shí)從第3周開始給予慢性應(yīng)激，應(yīng)激方式同模型二組，共應(yīng)激4周。從第一周開始，每周埋線一次，共6次。假埋線組組給予6周腹腔注射D-半乳糖(120mg/Kg/d)，同時(shí)從第3周開始給予慢性應(yīng)激，應(yīng)激方式同模型二組，共應(yīng)激4周。從第一周開始，每周假埋線一次，共6次。
　　埋線處方:選取“腎俞（雙）”、

4、“足三里（雙）”、“百會(huì)”、“太沖（雙）”作為穴位埋線處方。“腎俞（雙）”、“百會(huì)（雙）”一組，“太沖”和“足三里（雙）”一組，兩組交替埋線。
　　實(shí)驗(yàn)過程中，觀察大鼠毛發(fā)飲食精神活動(dòng)情況等一般狀態(tài)。于實(shí)驗(yàn)前、3周后、實(shí)驗(yàn)結(jié)束（6周）后稱量各組大鼠的體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)——反映衰老大鼠自主活動(dòng)能力的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及反映學(xué)習(xí)認(rèn)知記憶能力的水迷宮實(shí)驗(yàn)。行為學(xué)結(jié)束后立馬取材，通過HE染色及尼氏染色檢測(cè)觀察大鼠海馬的一般病理形態(tài)結(jié)構(gòu)

5、;通過電鏡檢測(cè)觀察海馬的超微結(jié)構(gòu);qPCR法檢測(cè)海馬中ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 mRNA的表達(dá);蛋白印記法(westernblot)檢測(cè)海馬中p-mTOR、ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.各組大鼠一般狀態(tài)改變
　　模型一組、模型二組、假埋線組大鼠經(jīng)過造模后，毛發(fā)凌亂晦暗、反應(yīng)遲鈍、精神倦怠少動(dòng)、飲食量減少、耳廓無(wú)光澤，且模型二組、假埋線組老化現(xiàn)象更明顯。

6、穴位埋線組的老化現(xiàn)象得到明顯改善。
　　2.各組大鼠體重結(jié)果
　　在造模期間，各組大鼠體重均有增長(zhǎng)?？瞻讓?duì)照組及模型一組的體重增長(zhǎng)速度最快，穴位埋線組大鼠的體重增長(zhǎng)較空白對(duì)照組緩慢，模型二組及假埋線組大鼠體重增長(zhǎng)最慢。
　　3.各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　與空白對(duì)照組相比，模型一組、模型二組、假埋線組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活躍度、中央?yún)^(qū)路程、中央?yún)^(qū)時(shí)間、總路程均減少(P＜0.05)，且模型二組及假埋線組較模型一組有升高或升高

7、趨勢(shì)。與模型二組相比，穴位埋線組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活躍度、中央?yún)^(qū)路程、中央?yún)^(qū)時(shí)間、總路程均增加(P＜0.05)
　　4.各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　經(jīng)過四天的定位航行試驗(yàn)訓(xùn)練，各組大鼠的逃避潛伏期均明顯減少，其中空白對(duì)照組及穴位埋線組變化趨勢(shì)最明顯，模型一組次之，模型二組及假埋線組大鼠逃避潛伏期變化趨勢(shì)最緩慢。在定位航行試驗(yàn)第四天，各組大鼠逃避潛伏期顯示明顯差異，與空白對(duì)照組相比，模型二組及假埋線組大鼠逃避潛伏期均升高(P＜0.0

8、5)，模型一組逃避潛伏期有升高趨勢(shì)(P＞0.05);與模型一組相比，模型二組及假埋線組逃避潛伏期有升高趨勢(shì)(P＞0.05);與模型二組相比，穴位埋線組大鼠逃避潛伏期降低(P＜0.05);與穴位埋線組相比，假埋線組大鼠逃避潛伏期升高(P＜0.01)。
　　與空白對(duì)照組相比，模型一組、模型二組及假埋線組穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P＜0.05);穴位埋線組穿越平臺(tái)次數(shù)較之模型一組、模型二組及假埋線組有升高趨勢(shì)(P＞0.05);模型一組、模型二組

9、及假埋線組三組之間穿越平臺(tái)次數(shù)進(jìn)行兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5.各組大鼠海馬HE染色結(jié)果
　　空白對(duì)照鼠海馬區(qū)神經(jīng)元豐富，結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊緊密。模型一組、模型二組、假埋線組海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少，排列紊亂，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞萎縮，且模型二組、假埋線組的病變程度比模型一組嚴(yán)重。穴位埋線組海馬區(qū)神經(jīng)元排列稍疏松，尚整齊，少量神經(jīng)元萎縮，細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯減少。
　　6.各組大鼠海馬尼氏染色結(jié)果

10、r>　　空白對(duì)照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常尼氏體清晰、豐富。模型一組、模型二組、假埋線組大鼠海馬神經(jīng)元排列紊亂，細(xì)胞間隙增大，尼氏體減少，且模型二組、假埋線組的病變程度比模型一組嚴(yán)重，尼氏體減少甚至消失。穴位埋線組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列還算整齊，但輕度疏松，細(xì)胞間隙稍增大，尼氏體清晰。
　　7.各組大鼠海馬電鏡超微結(jié)構(gòu)結(jié)果
　　空白對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)均正常有自噬小體的存在;

11、未觀察到脂褐素;突觸體數(shù)量多且大，微管結(jié)構(gòu)豐富。模型一組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核異形，線粒體數(shù)量減少、腫脹變性;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列紊亂，甚至出現(xiàn)脫顆粒現(xiàn)象;自噬小體數(shù)量較之空白對(duì)照組明顯增多;突觸體數(shù)量減少，體積縮小，樹突內(nèi)微管和微絲結(jié)構(gòu)存在溶解現(xiàn)象;脂褐素沉積增多。模型二組及假埋線組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷均較模型一組嚴(yán)重，自噬小體增多。穴位埋線組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)大致正常，細(xì)胞核呈圓形，核膜完整，核仁明顯，染色質(zhì)數(shù)

12、量多且分布均勻;線粒體數(shù)量尚可，偶有線粒體嵴不規(guī)則甚至消失，無(wú)空泡樣變性;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶有脫顆?，F(xiàn)象;可見自噬小體;突觸體結(jié)構(gòu)數(shù)量基本正常，樹突中微管微絲結(jié)構(gòu)大致正常
　　8.各組大鼠海馬ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 mRNA的表達(dá)結(jié)果
　　與空白對(duì)照組相比，模型一組海馬LC3-Ⅱ、P62 mRNA表達(dá)升高(P＜0.05)，ULK1、Beclin1 mRNA的表達(dá)有升高趨勢(shì)(P＞0.05);模型二組ULK1、L

13、C3-Ⅱ、P62 mRNA表達(dá)升高(P＜0.05)，Beclin1 mRNA的表達(dá)有升高趨勢(shì)(P＞0.05)。與模型一組相比，模型二組海馬LC3-Ⅱ mRNA、P62 mRNA表達(dá)升高(P＜0.05)，ULK1、Beclin1 mRNA的表達(dá)有升高趨勢(shì)(P＞0.05)。與模型二組相比，穴位埋線組海馬ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 mRNA表達(dá)均降低(P＜0.01)。與穴位埋線組相比，假埋線組海馬ULK1、Beclin1mR

14、NA、 LC3-Ⅱ、P62 mRNA表達(dá)升高(P＜0.05)。
　　9.各組大鼠海馬p-mTOR、ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表達(dá)結(jié)果
　　與空白對(duì)照組相比，模型一組大鼠海馬神經(jīng)元P62、Beclin1蛋白的表達(dá)有升高趨勢(shì)(P＞0.05)，LC3-Ⅱ、ULK1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），p-mTOR表達(dá)降低（P＜0.01）;模型二組LC3-Ⅱ、P62、ULK1、Beclin1蛋白表達(dá)均升高(P＜0.05

15、)，p-mTOR表達(dá)降低(P＜0.01)。與模型一組相比，模型二組大鼠海馬神經(jīng)元ULK1、P62、Beclin1、P62蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)，p-mTOR蛋白的表達(dá)有降低趨勢(shì)(P＞0.05)。與模型二組相比，穴位埋線組大鼠海馬神經(jīng)元ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表達(dá)均降低(P＜0.05)，p-mTOR表達(dá)升高P＜0.05）;假埋線組大鼠海馬神經(jīng)元ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 mRNA表達(dá)則無(wú)明顯

16、差異。
　　結(jié)論:
　　1.D-半乳糖致衰模型大鼠和復(fù)合衰老模型大鼠在一般狀態(tài)、自主活動(dòng)能力、學(xué)習(xí)認(rèn)知能力、海馬的一般病理組織學(xué)結(jié)構(gòu)以及超微結(jié)構(gòu)等方面都出現(xiàn)了衰老變化，自噬的活性下降，而慢性應(yīng)激可使D-半乳糖致衰模型大鼠的以上行為學(xué)、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)方面的衰老改變更加嚴(yán)重，說明復(fù)合衰老模型大鼠的模型建立成功。
　　2.穴位埋線對(duì)復(fù)合衰老模型大鼠的行為學(xué)，包括一般狀態(tài)、反映自主活動(dòng)能力的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、反映學(xué)習(xí)認(rèn)知記憶能力的

17、水迷宮實(shí)驗(yàn)都有改善作用。
　　3.穴位埋線可以改善復(fù)合衰老模型大鼠海馬神經(jīng)元的一般病理組織學(xué)結(jié)構(gòu)以及超微結(jié)構(gòu)。
　　4.穴位埋線通過抑制海馬神經(jīng)元異?？簥^的自噬啟動(dòng)及自噬小體形成、恢復(fù)自噬溶酶體的清除降解功能常，修復(fù)完整自噬流，清除海馬神經(jīng)元內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白或者受損老化的細(xì)胞器，使海馬神經(jīng)元恢復(fù)正常的生理活動(dòng)，延緩海馬的衰老進(jìn)程。
　　總之穴位埋線通過抑制海馬神經(jīng)元異?？簥^的自噬啟動(dòng)及自噬小體形成、恢復(fù)自噬溶酶體的清除降