SUMOylation對(duì)衰老心肌TFEB生物學(xué)作用及自噬的影響.pdf

1、背景：
　　現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，隨著衰老，心血管疾病的發(fā)生率逐年上升。據(jù)美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)（AHA）2015年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，首發(fā)心血管事件平均發(fā)生率在80歲人群較40歲人群高約25倍，且在65歲以上人群中心臟病位列致死原因首位。臨床和基礎(chǔ)研究都證實(shí)，老年心肌對(duì)各種損傷（如缺血）的耐受能力顯著減退且機(jī)制仍不明確。探索衰老心肌缺血易損的具體機(jī)制，提出針對(duì)性的老年心肌保護(hù)措施具有重要意義。
　　心肌細(xì)胞作為終末細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)異常事件的處理主要

2、依靠細(xì)胞內(nèi)自身途徑。因此，蛋白質(zhì)性能和細(xì)胞器質(zhì)量的控制對(duì)于心肌意義重大。自噬在心肌細(xì)胞器轉(zhuǎn)歸（如受損的線粒體）和紊亂蛋白聚集物降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用。老年個(gè)體心臟功能紊亂、抗損傷能力降低與衰老心肌自噬能力減退密切相關(guān)。與之對(duì)應(yīng)，上調(diào)基礎(chǔ)狀態(tài)下心肌自噬水平有助于保護(hù)衰老心肌，對(duì)抗不可逆性損傷。細(xì)胞自噬能力受多種因素調(diào)控，最新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子EB（TFEB）是介導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)控分子。TFEB是MIT/TFE轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，靜息

3、狀態(tài)下，TFEB定位于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞遭受饑餓或應(yīng)激后，TFEB轉(zhuǎn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控細(xì)胞自噬水平。TFEB對(duì)細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)，融合，降解的全過程發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。更為重要的，TFEB本身的轉(zhuǎn)錄活性受到翻譯后修飾的調(diào)控。已有的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MAPK家族的ERK可對(duì)TFEB進(jìn)行磷酸化修飾調(diào)節(jié)其核轉(zhuǎn)位。但是，TFEB在細(xì)胞核內(nèi)還會(huì)發(fā)生什么樣的翻譯后修飾？這種修飾對(duì) TFEB穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性有何影響？特別是，衰老心肌細(xì)胞核內(nèi)TFEB的翻譯后

4、修飾仍屬未知。針對(duì)心肌細(xì)胞核內(nèi)TFEB翻譯后修飾進(jìn)行干預(yù)是衰老心肌自噬調(diào)控的新內(nèi)容。
　　SUMOylation（小泛素相關(guān)修飾物，Small Ubiquitin-like Modifier,SUMO）作為一種重要的翻譯后修飾方式對(duì)蛋白質(zhì)的功能有廣泛的調(diào)節(jié)作用，主要包括調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位，蛋白質(zhì)之間的相互作用以及蛋白質(zhì)的活性等方面?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，SUMO化修飾涉及多種生物學(xué)過程中的大量蛋白質(zhì)，是心臟發(fā)育和功能完整的關(guān)鍵性調(diào)控事件。也

5、有研究顯示，SUMO化修飾異常與衰老心肌抗損傷能力減弱密切相關(guān)。SUMOylation的底物蛋白多位于細(xì)胞核內(nèi)，且含有ψKXE模塊序列（ψ：疏水氨基酸；K：賴氨酸，X：任意氨基酸)。我們采用SUMOplot分析程序發(fā)現(xiàn)TFEB在K348位點(diǎn)具有SUMOylation所必須的ψKXE模塊序列(347VKQE350)。因此，本研究旨在探討衰老心肌自噬功能障礙過程中 SUMOylation發(fā)揮什么樣的作用？SUMOylation是否與自噬調(diào)控

6、的關(guān)鍵分子TFEB存在生物學(xué)聯(lián)系？
　　目的：
　　1，明確心肌細(xì)胞核內(nèi)SUMO化修飾對(duì)TFEB自噬調(diào)控的影響；
　　2，證實(shí)TFEB-SUMO化修飾減退是否參與衰老心肌自噬功能障礙；
　　3，明確干預(yù)TFEB-SUMO化修飾能否改善衰老心肌自噬功能發(fā)揮心肌保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　本實(shí)驗(yàn)采用成年（4-6月齡）及老年（22-24月齡）雄性C57BL/6小鼠，提取組織蛋白，通過免疫共沉淀方法檢測(cè)T

7、FEB與SUMO1分子間作用，蛋白免疫印跡、實(shí)時(shí)定量PCR等方法檢測(cè)TFEB，SUMO1，自噬相關(guān)蛋白LC3、Atg5、Beclin1及溶酶體相關(guān)蛋白LAMP1等分子的表達(dá)水平。采用小劑量雷帕霉素（0.25mg/kg）處理成年及老年小鼠8周，檢測(cè)上述分子變化。采用重組腺相關(guān)病毒9型（rAAV9）為載體在體抑制成年小鼠或過表達(dá)老年小鼠心肌SUMO1，腺病毒為載體抑制心肌TFEB，并構(gòu)建心肌缺血/再灌注模型，提取組織蛋白，采用蛋白免疫印跡方

8、法檢測(cè)TFEB，SUMO1，自噬相關(guān)蛋白LC3、Atg5、Beclin1及溶酶體相關(guān)蛋白LAMP1等分子的表達(dá)水平，TUNEL染色、伊文氏藍(lán)-TTC雙染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡及梗死面積。
　　結(jié)果：
　　1，采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，80kD的細(xì)胞核TFEB與SUMO1結(jié)合，發(fā)生了SUMOylation修飾；而68kD的胞漿TFEB并沒有與SUMO1結(jié)合。結(jié)果證實(shí)：心肌TFEB可以被SUMO化修飾（SUMOylated TFEB）

9、，且主要發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)。
　　2，衰老心肌中TFEB水平較成年心肌顯著降低。并且，對(duì)比成年心肌，衰老心肌細(xì)胞核中SUMO化修飾的TFEB水平顯著減退（P<0.05，n=5）。
　　3，與成年心肌相比，衰老心肌自噬功能顯著減退，表現(xiàn)為:自噬誘導(dǎo)因子LC3，beclin-1,Atg5表達(dá)減退；溶酶體蛋白LAMP2表達(dá)減退；自噬底物蛋白p62顯著增加。
　　4，在成年組，小劑量雷帕霉素處理可有效促進(jìn)TFEB入核，提高核內(nèi)TF

10、EB水平并增強(qiáng)自噬。但是，對(duì)老年C57小鼠在體給予小劑量雷帕霉素處理，以成年C57小鼠為對(duì)照，我們發(fā)現(xiàn)，雖然雷帕霉素顯著增加了成年心肌細(xì)胞核中TFEB水平，而老年小鼠心肌細(xì)胞核中TFEB水平并沒有顯著提高。為了明確TFEB的SUMOylation修飾和心肌自噬轉(zhuǎn)錄調(diào)控之間的聯(lián)系，采用rAAV9為載體在體給予sh-SUMO1干預(yù)，利用rAAV9的親心肌特性成功實(shí)現(xiàn)心肌SUMO1的敲低。重要的結(jié)果顯示，隨著SUMO1的敲低，心肌細(xì)胞核內(nèi)TF

11、EB水平隨之減退（P<0.05,n=5）。并且，受TFEB調(diào)控的自噬相關(guān)蛋白LC3，LAMP2也被抑制。該結(jié)果提示，SUMO化修飾是心肌細(xì)胞核內(nèi)TFEB保持蛋白穩(wěn)定和轉(zhuǎn)錄活性的重要條件。
　　5，反之，采用rAAV9為載體在體心肌過表達(dá)SUMO1水平，可顯著改善衰老心肌細(xì)胞核內(nèi)TFEB蛋白水平，并隨之增強(qiáng)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　6，采用shRNA抑制TFEB表達(dá)后，SUMO1上調(diào)所引起的自噬增加效應(yīng)隨之消失，表現(xiàn)為L(zhǎng)C

12、3、LAMP1表達(dá)均明顯下調(diào)。證實(shí)TFEB的SUMO修飾是衰老心肌自噬調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　7，在上述基礎(chǔ)上，通過調(diào)節(jié)TFEB的SUMO化修飾水平改善衰老心肌基礎(chǔ)自噬水平可顯著改善衰老心肌抗缺血損傷能力，減少心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：
　　1，本研究證明了細(xì)胞核的SUMO化修飾TFEB調(diào)控心肌細(xì)胞自噬，并證明心肌細(xì)胞核內(nèi)的TFEB-SUMO化修飾功能減退是衰老心肌基礎(chǔ)自噬功能障礙的重要機(jī)制。因此改善TFE