地塞米松激活自噬對軟骨細胞衰老影響的研究.pdf

1、目的:
　　早期采用關(guān)節(jié)腔注射糖皮質(zhì)激素可以緩解疼痛并取得良好效果，但是，長期反復注射地塞米松可破壞軟骨細胞的代謝平衡，并可以引起軟骨細胞的死亡或凋亡，從而減少軟骨細胞數(shù)量和導致膝關(guān)節(jié)軟骨組織退變程度進一步加重的后果。因此，探索糖皮質(zhì)激素副作用的機制并尋找應對策略，確保其療效又減少副作用，顯得尤為重要。自噬是否是軟骨細胞在糖皮質(zhì)激素下適應性地升高而對軟骨產(chǎn)生一個保護作用？自噬與衰老在地塞米松作用下的關(guān)系又如何？尚不得而知。

2、　　方法：
　　1.地塞米松對軟骨細胞自噬和衰老的影響
　　1.1 大鼠原代膝關(guān)節(jié)軟骨細胞培養(yǎng):
　　用解剖刀將膝關(guān)節(jié)軟骨組織切成1mm3的小塊，放入培養(yǎng)皿，用PBS淹蓋。收集全部切碎的軟骨組織，去除PBS，加入適量的0.5％透明質(zhì)酸酶，室溫下作用5分鐘。除去透明質(zhì)酸酶，再次加入適量新鮮的0.5％透明質(zhì)酸酶室溫下作用10分鐘。用0.2％胰蛋白酶沖洗軟骨組織碎塊2次，去除用過的胰蛋白酶，加入適量新鮮的0.2％胰蛋白酶，3

3、7℃下作用30分鐘。去除胰蛋白酶，用PBS清洗2次。用適量的0.2％膠原酶清洗5分鐘，去除清洗液后再加入適量膠原酶，37℃下作用90分鐘。收集上清液，離心三次，收集細胞，把細胞懸浮于適量培養(yǎng)液中（含12％FCS）在75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
　　1.2 試驗分組:
　　地塞米松分為5組:空白組，0.1m g/L，1mg/L，25mg/L，50mg/L。3-MA與地塞米松(DXM)混合分為5組:空白組、10 mmol/L3-MA

4、、10 mmol/L3-MA+25mg/L DXM、25mg/L DXM。
　　時間點:軟骨細胞與上述各組混合培養(yǎng)后第2天，第4天，第6天。
　　1.3 Western blot檢測軟骨細胞的LC-3，Beclin-1的蛋白表達
　　提取和測定總蛋，蛋白制樣及電泳，將蛋白質(zhì)進行轉(zhuǎn)膜，濕轉(zhuǎn)法，封閉與顯色
　　1.4 LysoTracker Red染色
　　不同濃度的地塞米松作用軟骨細胞4天后。使用新鮮的培養(yǎng)基

5、洗滌細胞3遍，滴加LysoTracker Red后在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30分鐘。使用綠色濾光片在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞的染色情況。
　　1.5 MDC染色
　　經(jīng)處理關(guān)節(jié)軟骨細胞使用PBS清洗3遍后，使用MDC在37℃培養(yǎng)箱孵育30分鐘。PBS洗滌細胞3次，使用紫外激發(fā)光直接在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞。染色后的細胞再上流式細胞儀進行細胞自噬率的檢測。
　　2.大鼠成體祖細胞(MAPC)與軟骨細胞共培養(yǎng)誘導其向軟骨細

6、胞分化
　　2.1 MAPC原代培養(yǎng)及鑒定
　　抽取SD大鼠骨髓5 ml注入培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)1天后換液，移去未貼壁細胞，每3天換液1次。細胞80％～90％融合后PBS洗滌2次，胰酶消化1分鐘，用吸管吹打至單細胞懸液，離心10分鐘后棄去上清液，接種于培養(yǎng)瓶中。倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況，錐蟲藍染色，計數(shù)活細胞數(shù)，取平均值。將第2代MAPC消化，加入熒光標記抗體，用PBS洗去多余抗體，流式細胞儀檢測細胞陽性率。
　　2.

7、2 軟骨細胞原代培養(yǎng)及鑒定
　　將SD大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨切成約2 mm3置于無菌試管，PBS沖洗后下離心3分鐘。逐次用胰酶及Ⅱ型膠原酶放置孵箱內(nèi)消化。收集消化液離心3分鐘后棄去上清液，以1×105/ml接種于含有DMEM培養(yǎng)液的營養(yǎng)瓶中。原代細胞貼壁融合后傳代培養(yǎng)，2天換液一次。觀察軟骨細胞的形態(tài)并甲苯胺藍染色鑒定。
　　2.3 MAPC與軟骨細胞共培養(yǎng)
　　收集第2代軟骨細胞吹打成單細胞懸液，接種于Transwell6孔

8、板下層，對照組上層放置培養(yǎng)基，實驗組將第二代MAPC細胞以同樣密度接種于上層，孔徑為0.3μm的聚碳酸酯膜隔置于中間。觀察細胞形態(tài)變化，兩天換液1次。
　　2.4 共培養(yǎng)對MAPC轉(zhuǎn)化軟骨細胞對比
　　共培養(yǎng)4天后移去上層，將對照組和實驗組的細胞懸液放置于5％胎牛血清培養(yǎng)液中，每2天換液一次，第7天終止培養(yǎng)，軟骨細胞用抗Ⅱ型膠原抗體熒光標記。隨機在實驗組和對照組各選取10個視野，用雙盲法分別計數(shù)兩組在熒光顯微鏡下陽性細胞比例

9、，取平均值并進行統(tǒng)計學分析。
　　3.單純切除前交叉韌帶建立SD大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎動物模型
　　3.1 手術(shù)操作
　　用3.5％水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠后，常規(guī)備皮消毒手術(shù)區(qū)域。取膝關(guān)節(jié)髕旁內(nèi)側(cè)切口，切開皮膚及關(guān)節(jié)囊進入關(guān)節(jié)腔，向外側(cè)牽拉開髕骨，盡量屈曲膝關(guān)節(jié)以顯露前交叉韌帶，在直視下橫向切斷前交叉韌帶并行前抽屜試驗確認已完全斷裂。逐層縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚。
　　3.2 術(shù)后處理
　　每天每只大鼠肌肉注射青霉素

10、20萬單位預防感染持續(xù)3天。大鼠分別于術(shù)后2周、4周、6周脫頸處死。取關(guān)節(jié)軟骨以10％福爾馬林固定后行組織學切片觀察。
　　3.3 評估分期
　　膝關(guān)節(jié)軟骨行HE染色、Masson染色及甲苯胺藍染色，根據(jù)不同時間點進行Mankin評分。
　　4.體內(nèi)試驗部分
　　4.1 建立大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎模型
　　SD大鼠水合氯醛腹腔麻醉后膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱向切口，切斷前交叉韌帶，注意勿損傷關(guān)節(jié)軟骨面，逐層縫合關(guān)閉創(chuàng)口。術(shù)后每

11、天每只注射丁胺卡那霉素，連續(xù)3天，籠內(nèi)自由活動。術(shù)后6周大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎模型建立。地塞米松藥液的配置:一支劑量為0.125g(5ml)，按照成人體重60kg計算，人體常規(guī)用量為0.42mg/kg，按照人和大鼠用藥劑量換算公式為:大鼠劑量(mg/kg)=6.25×0.42mg/kg。即每只大鼠(270g)每次注射0.709mg(0.028ml)即為相應人體的常規(guī)劑量。
　　4.2 實驗分組:
　　SD大鼠30只，分為A、B、C

12、三組，每組各10只，A組僅切開皮膚模擬造模手術(shù)6周后在膝關(guān)節(jié)注射地塞米松， B組單純前交叉韌帶切斷造模術(shù)后6周在膝關(guān)節(jié)腔中注射地塞米松，C組單純前交叉韌帶切斷造模術(shù)后6周在膝關(guān)節(jié)腔中注射生理鹽水。每組里面又分2個小組（即A1、A2，B1、B2，C1、C2）;A1、B1和C1組為術(shù)后6周注射一次藥物;A2、B2和C2組為術(shù)后6周注射第一次藥物和術(shù)后7周注射第二次藥物。隨機取材行膝關(guān)節(jié)軟骨組織進行HE染色、Masson染色、番紅O固綠染色、

13、β-半乳糖苷酶染色和LC3免疫組化染色，分別在鏡下觀察HE染色切片，Masson染色切片，番紅O/固綠染色切片，β-半乳糖苷酶染色切片和LC3免疫組化切片并評估衰老和自噬。
　　結(jié)果：
　　1.地塞米松對軟骨細胞自噬和衰老的影響
　　經(jīng)地塞米松處理的軟骨細胞MDC染色和流式細胞儀分析。隨著地塞米松濃度的上升，軟骨細胞的MDC染色熒光強度明顯增加。經(jīng)地塞米松作用后軟骨細胞自噬的發(fā)生率與對照組相比明顯升高，具有統(tǒng)計學意義。

14、
　　培養(yǎng)4天后，與對照組相比，地塞米松明顯促進軟骨細胞胞漿中點狀的紅色熒光和黃色熒光的數(shù)量，融合后形成點狀的黃色自噬體已經(jīng)部分紅色的自噬溶酶體，并且具有劑量依賴性，這提示地塞米松可以明顯促進軟骨細胞中自噬流的形成，使得細胞中的自噬體逐漸地轉(zhuǎn)化成為自噬溶酶體。
　　2.成體祖細胞(MAPC)與軟骨細胞共培養(yǎng)誘導前者向軟骨細胞分化
　　在培養(yǎng)后24小時內(nèi)原代MAPC大多數(shù)貼壁，呈多角形。24小時內(nèi)換液，以后每2天換液1次

15、，8天內(nèi)貼壁其他細胞多死亡。剩余MAPC形態(tài)為長條形或梭形，呈克隆樣生長。傳代的MAPC細胞在1天內(nèi)即出現(xiàn)生長，倍增時間約為2天。
　　SD大鼠軟骨細胞在24小時內(nèi)貼壁，呈三角形或四角形，6天內(nèi)貼壁的其他細胞多死亡。剩余的軟骨細胞生長旺盛，甲苯胺藍染色顯示軟骨細胞存活及傳代較穩(wěn)定。
　　3.單純切除前交叉韌帶建立SD大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎模型
　　術(shù)后2周HE染色見軟骨表面出現(xiàn)少數(shù)散在的不規(guī)則裂隙;甲苯胺藍染色均勻且呈深藍;

16、Masson染色軟骨基質(zhì)被染成藍色，染色較均勻，細胞排列規(guī)則。
　　術(shù)后4周HE染色見軟骨細胞輕度增生，細胞排列開始出現(xiàn)紊亂，軟骨淺層出現(xiàn)裂隙，表層及中層細胞收縮;甲苯胺藍染色不均勻;Masson染色軟骨基質(zhì)被染成藍紅相間色，細胞分布規(guī)則。
　　4.地塞米松對膝骨性關(guān)節(jié)炎動物模型的作用
　　β-半乳糖苷酶染色:A1與B1，C1均有顯著性差異，A2和B2有顯著性差異，B2和C1有顯著性差異;LC3免疫組化:A1與B1有顯

17、著性差異，A2與B2有顯著性差異，B2與C2有顯著性差異。
　　局部注射地塞米松后B1和C1兩組及B2和C2兩組均無明顯差異，并沒有導致軟骨衰老加重;軟骨細胞自噬則表現(xiàn)出收到地塞米松的誘導作用，所以與前面體外軟骨細胞部分研究結(jié)果相似，地塞米松誘導軟骨細胞自噬同時抑制了衰老，因此可以解釋有許多患者膝關(guān)節(jié)局部注射封閉后自覺疼痛癥狀緩解。
　　結(jié)論：
　　1.地塞米松誘導軟骨細胞的衰老，并同時激活軟骨細胞中的自噬，而自噬在這