熒光定量PCR檢測(cè)哈維氏弧菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)過程中的基因表達(dá).pdf

1、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)是廣泛存在于海洋環(huán)境中的一種發(fā)光性革蘭氏陰性菌,也是引起海洋動(dòng)物弧菌病的重要條件性病原菌,能夠感染多種海洋脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物?；畹姆强膳囵B(yǎng)狀態(tài)(Viable but nonculturable state,VBNC)指細(xì)菌處于不良環(huán)境時(shí)細(xì)胞縮成球形,用常規(guī)方法培養(yǎng)時(shí)不能生長(zhǎng)繁殖,但仍然具有代謝活性及致病力的一種特殊存在形式。在適當(dāng)條件下VBNC狀態(tài)的細(xì)菌能夠恢復(fù)為可培養(yǎng)狀態(tài)。已有研究發(fā)現(xiàn),哈維

2、氏弧菌在低溫寡營(yíng)養(yǎng)條件下能夠進(jìn)入VBNC狀態(tài)。本論文建立了檢測(cè)哈維氏弧菌基因表達(dá)的熒光定量PCR方法,研究了熱激和冷激條件下。Vhh、hsp、cysS、oppA、MnSOD和rpoS基因的表達(dá),并進(jìn)一步研究哈維氏弧菌從誘導(dǎo)進(jìn)入VBNC狀態(tài)到完成復(fù)蘇的整個(gè)過程中,這幾種基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。
　　 哈維氏弧菌SF-1置于40℃水浴中進(jìn)行熱激處理,處理時(shí)間分別為0min、10min、20min、30min、50min。對(duì)各處理樣品進(jìn)行

3、熒光定量PCR的結(jié)果顯示,hsp基因在熱激處理時(shí)表達(dá)量明顯增加,熱激處理前期表達(dá)量的增加尤其顯著。MnSOD基因在熱激10min時(shí)表達(dá)量升高為原來的9.641倍,隨后逐漸下降,到50min時(shí)其表達(dá)量大致恢復(fù)到正常水平。oppA基因的表達(dá)量隨著熱激時(shí)間的延長(zhǎng)有明顯下降趨勢(shì)。Vhh、cysS和rpoS基因的表達(dá)量在熱激過程前期略有升高,隨后明顯下降。
　　 哈維氏弧菌SF-1置于4℃冰箱中進(jìn)行冷激處理,處理時(shí)間分別為0h、1h、2h

4、、4h、8h、12h。對(duì)各處理樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在冷激處理過程中vhh基因和cysS基因的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。oppA基因表達(dá)量沒有明顯的規(guī)律性。MnSOD、rpoS和hsp基因的表達(dá)在整個(gè)冷激過程中明顯增加。
　　 哈維氏弧菌SF-1接種在人工海水中進(jìn)行低溫(4℃)培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)它在低溫寡營(yíng)養(yǎng)條件下誘導(dǎo)84d時(shí)進(jìn)入VBNC狀態(tài)。應(yīng)用熒光定量PCR的方法,對(duì)哈維氏弧菌VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)及復(fù)蘇全過程中6個(gè)毒力相關(guān)和應(yīng)激相

5、關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)在低溫誘導(dǎo)前期rpoS、cysS和vhh基因表達(dá)量均比正常狀態(tài)增加,隨著低溫誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),3種基因的表達(dá)量逐漸減少,進(jìn)入VBNC狀態(tài)后rpoS、cysS和vhh基因的表達(dá)量分別下降為原來的0.037倍、0.055倍和0.232倍,復(fù)蘇后rpoS基因表達(dá)量約為正常狀態(tài)時(shí)的0.674.倍,而cysS基因和vhh基因表達(dá)量則均恢復(fù)到正常水平。Hsp、oppA和MnSOD基因表達(dá)量在低溫誘導(dǎo)過程及進(jìn)入VBNC