C末端缺失的GATA4通過增強AKT-FOXO的表達促進心肌細胞凋亡.pdf

1、目的:GATA4是參與心臟發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子。本課題組前期在室間隔缺損(ventricular septal defect，VSD)患者心肌組織中發(fā)現(xiàn)了一種特殊類型的GATA4突變(p.S335X)，此突變可使終止密碼子提前產(chǎn)生，導(dǎo)致GATA4的C末端缺失。為進一步了解p.S335X突變對心肌細胞的作用及其機制，我們使用體外培養(yǎng)的大鼠心肌細胞株H9C2，轉(zhuǎn)染野生型GATA4(pcDNA6-GATA4-WT，WT)及突變型GATA4 p.

2、S335X(pcDNA6-GATA4-MU，MU)載體，驗證轉(zhuǎn)染效率后，考察GATA4 p.S335X對H9C2細胞凋亡的影響及經(jīng)典凋亡通路AKT/FOXO/Bcl-2的參與作用。在此基礎(chǔ)上，我們進一步篩選了除經(jīng)典Bcl-2凋亡途徑之外，GATA4p.S335X對其他凋亡相關(guān)的下游分子/信號通路的調(diào)控作用。
　　方法:大鼠心肌細胞H9C2體外培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T、MU及對照(pcDNA6，EV)載體，通過收集轉(zhuǎn)染后H9C2細胞的RNA和

3、總蛋白，分別使用Real-TimePCR和Western blot驗證細胞中GATA4mRNA和蛋白表達，鑒定轉(zhuǎn)染成功。進一步使用TUNEL法檢測細胞凋亡;通過Real-Time PCR和Western blot分別測定經(jīng)典凋亡通路AKT/FOXO/Bcl-2相關(guān)因子的mRNA表達、蛋白表達及關(guān)鍵酶的磷酸化水平;以PCR Array技術(shù)篩選新的凋亡信號通路。
　　結(jié)果:Real-Time PCR結(jié)果證實，WT和MU組GATA4 m

4、RNA表達顯著升高;Western blot結(jié)果顯示:WT和MU組GATA4蛋白表達顯著增多，且較之WT組，MU組GATA4蛋白分子量較低(WT組:50KDa，MU組:40KDa);上述結(jié)果提示GATA4 WT和MU轉(zhuǎn)染成功。TUNEL結(jié)果表明，未加TNF時轉(zhuǎn)染MU的H9C2細胞比轉(zhuǎn)染W(wǎng)T的H9C2細胞內(nèi)可見更明顯的凋亡，加入TNF(100ng/ml)后，MU與EV組凋亡明顯高于WT組，提示GATA4WT對凋亡具有一定抑制作用，該作用在

5、GATA4MU條件下被反轉(zhuǎn)。Western blot結(jié)果顯示:MU組中調(diào)促進凋亡信號GSK3β，p-GSK3β，F(xiàn)OXO3、BAX表達上調(diào)，抑制凋亡信號AKT、p-AKT、Bcl-2表達降低;而Real-Time PCR結(jié)果顯示上述因子的mRNA表達沒有差異。PCRArray篩選出下列基因表達在MU組中升高:Tp53、Tp53bp2、Bcl-10、Casp3、Gadd45α、Jun、Mapk14、Mapk8、Pdgfra、Pdk2、Pd

6、pk1、Tsc1，Casp7、Ltbr、Mapk8ip1、Tnfsf10、Pdk1、 Pik3r1。
　　結(jié)論: GATA4 p.S335X不具備野生型GATA4抑制細胞凋亡的功能;該現(xiàn)象可能與經(jīng)典的AKT/FOXO/Bcl-2途徑有關(guān);此外，C末端缺失的GATA4p.S335X還可能作用于非典型凋亡途徑，包括:p53/Tnfsf10、MAPK/Gadd45α、JNK/c-jun、PDK1/PKC/Bcl10/caspase7等。