使用腺病毒過表達TXNIP對H9C2心肌細胞損傷和凋亡的影響.pdf

1、研究背景：
　　近年來，全球糖尿病的發(fā)病率、死亡率明顯上升，已成為威脅人類健康與壽命的最重要疾病之一。糖尿?。―iabetesMellitus）是由遺傳和環(huán)境等因素引起胰島素絕對或相對不足，導致糖、脂肪、蛋白質代謝異常，而以慢性高血糖為主要表現(xiàn)的一組臨床綜合征。除引起糖脂代謝的紊亂外，糖尿病可引起心、腎、腦等多個器官的合并癥，其中以心臟并發(fā)癥最為危險，是導致糖尿病人死亡的最主要原因。
　　本實驗室前期的研究顯示，無論是高糖高

2、脂喂養(yǎng)結合鏈脲佐菌素注射造成的慢性2型糖尿病大鼠模型，還是高糖高脂刺激的培養(yǎng)心肌細胞，均觀察到明顯的心肌細胞損傷和凋亡，其機制與高糖高脂刺激引起硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)的活性下降有關，而硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxininteractingprotein,TXNIP)的表達明顯上調，是糖尿病引起Trx功能下降的重要原因。
　　TXNIP是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種內源性的Trx結合抑制蛋白，在腫瘤、糖尿病

3、等疾病中發(fā)揮作用。本實驗室之前在高糖高脂喂養(yǎng)結合小劑量鏈脲佐菌素注射制備的2型糖尿病模型和高糖高脂刺激的培養(yǎng)成鼠心肌細胞上都發(fā)現(xiàn)了TXNIP表達的顯著增加，而且是糖尿病時Trx系統(tǒng)相關各蛋白中變化最明顯的一個，同時觀察到糖尿病或高糖高脂刺激引起了心肌細胞的損傷和凋亡。但是TXNIP的上調僅僅是糖尿病時一種繼發(fā)的伴隨性變化，還是本身參與了糖尿病細胞損傷的發(fā)生，尚不清楚。為分析此問題，我們前期構建了TXNIP的干擾質粒并轉染培養(yǎng)的H9C2細

4、胞，觀察抑制高糖高脂引起的TXNIP表達，是否可以減輕心肌細胞的損傷和凋亡。結果表明，使用RNA干擾技術減弱TXNIP的上調后，高糖高脂刺激引起的心肌細胞損傷和細胞凋亡減輕，Trx的活性顯著提高，可以證明TXNIP的上調是糖尿病引起心肌細胞損傷的重要環(huán)節(jié)。
　　考慮到前述研究均是在糖尿病或模擬條件下的觀察，研究TXNIP的作用時仍不能排除高糖高脂的直接或TXNIP以外的損傷途徑，因此，為進一步明確TXNIP的表達升高本身是否足以引

5、起心肌細胞損傷的發(fā)生設計了本實驗，采用腺病毒轉染培養(yǎng)的H9C2細胞，使心肌細胞過表達TXNIP，觀察單純TXNIP增多對正常糖脂培養(yǎng)條件下心肌細胞損傷和凋亡的影響，并對其損傷機制進行了簡要分析。
　　目的：
　　運用病毒轉染技術，使心肌細胞過表達TXNIP，以觀察正常培養(yǎng)條件下細胞單純過表達TXNIP是否可以引起心肌細胞凋亡，并對其機制進行分析，以明確TXNIP在糖尿病心肌細胞凋亡中的作用及其途徑。
　　方法：

6、　　1.使用腺病毒轉染技術使心肌細胞過表達TXNIP
　　使用處在對數(shù)生長期的H9C2細胞，細胞隨機分為3組，即：正常培養(yǎng)組、不含目的基因的腺病毒對照組（Ad-eGFP組）、TXNIP過表達（Ad-TXNIP-eGFP）組；在轉染前一天分別換液處理，第二天進行轉染，病毒滴度按每個細胞100個病毒顆粒計算。4h后補加含10％胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，24h后換液處理，繼續(xù)培養(yǎng)至72h，中間觀察病毒轉染效率。
　　2.確定轉染

7、效率
　　利用熒光倒置顯微鏡拍攝同一個視野下的轉染細胞，計算同一個視野下帶綠色熒光蛋白細胞占整個視野下所有細胞的百分比計算轉染效率。同時使用Real-timePCR方法測定轉染H9C2心肌細胞TXNIP的mRNA表達。
　　3.分析TXNIP在心肌細胞損傷和凋亡中的作用
　　通過前兩部分實驗，確定轉染率相對最高的時間點，分別收集各組培養(yǎng)細胞核培養(yǎng)基，測定乳酸脫氫酶（LDH）活性、丙二醛（MDA）和3-硝基酪氨酸含量、p

8、38激酶、caspase-3及Trx活性,并用流式細胞術檢測細胞凋亡率，用westernblot方法分別測TXNIP和Trx蛋白的表達量。
　　結果：
　　1.轉染效率
　　1.1熒光顯微鏡觀察轉染效率
　　鏡下觀察轉染成功，24h、48h、72h轉染效率分別為：9.94％±1.12％、68.50％±4.57％、88.86％±3.23％，其中轉染72h的轉染效率顯著高于轉染24h(P<0.01)和轉染48h(P<

9、0.01)，因此該部分實驗我們選擇轉染72h的細胞做后續(xù)實驗分析（圖1）。
　　1.2Real-timePCR方法測定轉染H9C2心肌細胞TXNIP的mRNA表達
　　與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組細胞TXNIP的mRNA無顯著性變化（mRNA0.99±0.13vs.1.08±0.26;P>0.05），TXNIP過表達組與Ad-eGFP組相比：TXNIP的mRNA水平顯著升高（mRNA1.24±0.28vs.1.08±0

10、.26;P<0.05），說明構建載體、病毒包裝、細胞轉染、過表達目的基因成功（圖2A,2B）。
　　1.3WesternBlot方法測定轉染成功后TXNIP表達增高、Trx蛋白表達未見明顯改變
　　如圖3所示：Ad-eGFP組與正常對照相比TXNIP蛋白表達無顯著改變（0.98±0.06vs.1.03±0.14；P>0.05），而與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP的TXNIP過表達組TXNIP蛋白水平明顯升高

11、(1.21±0.09vs.1.03±0.14；P<0.01)，同時測定發(fā)現(xiàn)Trx蛋白表達沒有顯著性的變化(1.14±0.09vs.1.09±0.05；P>0.05)，說明TXNIP表達增高對Trx的蛋白表達無明顯影響（見圖4）。
　　1.4Trx活性測定
　　如圖5所示：與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組細胞Trx活性無顯著性變化（0.14±0.03vs.0.13±0.01;P>0.01），與Ad-eGFP組相比，TXNIP

12、過表達組Trx活性明顯降低（0.02±0.05vs.0.13±0.01;P<0.01），提示TXNIP的過表達不會引起Trx的蛋白表達量的改變但是會明顯的抑制Trx的活性。
　　1.5乳酸脫氫酶（LDH）活性的變化
　　如圖6所示：與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組LDH活性沒有顯著性的差異（1344.53±127.12U/Lvs.1367.30±118.88U/L;P>0.05）；而與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP

13、-eGFP組LDH活性顯著升高(1528.20±117.80U/Lvs.1367.30±118.88U/L;P<0.01)，提示TXNIP表達增高可引起心肌細胞損傷。
　　1.6MDA生成測定
　　MDA是常用的反映膜脂質過氧化損傷程度的指標。本實驗中，與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組MDA含量無顯著差別（14.65±2.14μMvs.13.14±2.36μM；P>0.01）；與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eG

14、FP組MDA生成顯著升高(17.92±0.91μMvs.13.14±2.36μM；P<0.01)（圖7），提示TXNIP過表達引起氧化應激增加，自由基損傷加重。
　　1.73-硝基酪氨酸含量測定
　　3-硝基酪氨酸是蛋白質被過氧化亞硝酸自由基（ONOO-）硝基化修飾的產(chǎn)物，常作為反映過氧化亞硝酸自由基生成量及蛋白硝基化水平的指標。如圖8所示，與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組3-硝基酪氨酸生成無顯著性變化（1.28±0.35

15、μg/mLvs.1.15±0.27μg/mL;P>0.01）；與Ad-eGFP組相比，TXNIP過表達組3-硝基酪氨酸生成顯著增加（1.63±0.56μg/mLvs.1.15±0.27μg/mL;P<0.01），提示TXNIP明顯的增加了過氧化亞硝酸自由基及其損傷的發(fā)生。
　　1.8caspase-3活性測定
　　caspase-3的激活是細胞凋亡發(fā)生的主要途徑，如圖9所示，與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組caspase-

16、3活性無顯著性變化（0.29±0.22nmol/h/mgprovs.0.68±0.31nmol/h/mgpro；P>0.05），而Ad-TXNIP-eGFP組與Ad-eGFP組相比，caspase-3活性明顯增高（1.79±0.53nmol/h/mgprovs.0.68±0.31nmol/h/mgpro；P<0.05），提示TXNIP過表達引起明顯的心肌細胞的凋亡發(fā)生。
　　1.9p38激酶活性
　　p38激酶是介導氧應激損

17、傷、激活caspase依賴凋亡途徑的重要激酶。如圖10所示，與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組p38激酶活性無明顯改變（1.08±0.05vs.1.07±0.04；P>0.05），而Ad-TXNIP-eGFP組與Ad-eGFP組相比，p38激酶活性顯著升高(1.26±0.06vs.1.07±0.04；P<0.05)。
　　1.10流式細胞儀測凋亡
　　如圖11所示，正常培養(yǎng)組與不含TXNIP的Ad-eGFP組間細胞凋亡率無顯