受損心肌細(xì)胞通過與骨髓干細(xì)胞融合而避免凋亡.pdf

1、背景：
　　 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的患者，其冠狀動(dòng)脈管腔由于粥樣硬化而狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌缺血和缺氧。無論是冠心病造成的心肌缺血缺氧，還是我們現(xiàn)代再灌注治療涉及到的再灌注損傷，都會造成心肌的凋亡及壞死。而自由基的氧化應(yīng)激在其中發(fā)揮了重要的作用。
　　 骨髓干細(xì)胞是成體干細(xì)胞其中一員。它們包括了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及骨髓造血干細(xì)胞。它們都具有多能分化的特性，與組織修復(fù)有關(guān)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞至少可分化為軟骨、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)

2、胞及平滑肌細(xì)胞，有研究更發(fā)現(xiàn)其可分化為心肌樣細(xì)胞。骨髓造血細(xì)胞可分化成各種血細(xì)胞及非血細(xì)胞。近年骨髓干細(xì)胞心臟移植已被證明可以改善受損心臟的功能。其機(jī)理可能和以下幾方面有關(guān)：促進(jìn)血管生成，改善心臟的血液循環(huán)；分泌細(xì)胞因子，改善心肌微環(huán)境；干細(xì)胞再生為心肌細(xì)胞，補(bǔ)充了心肌細(xì)胞的數(shù)量。
　　 近年研究發(fā)現(xiàn)骨髓干細(xì)胞可以與肝臟細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及人熱休克小氣道內(nèi)皮細(xì)胞融合。而骨髓干細(xì)胞與心肌細(xì)胞的融合仍有待研究。于是我們假設(shè)：心肌細(xì)胞與骨

3、髓干細(xì)胞融合，是心肌細(xì)胞避免凋亡的一種生存方式。為了證實(shí)假設(shè)，我們設(shè)計(jì)了離體和活體實(shí)驗(yàn)。離體實(shí)驗(yàn)是在原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)液里加入過氧化氫，使心肌細(xì)胞趨向于凋亡，將骨髓干細(xì)胞按一定比例加入到受損的心肌細(xì)胞里共培養(yǎng)。檢測細(xì)胞融合及凋亡的情況；活體實(shí)驗(yàn)是將RFP陽性小鼠作左前降支結(jié)扎術(shù)，立即將GFP陽性的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞直接注射到壞死區(qū)邊緣，一周后檢測心肌內(nèi)細(xì)胞融合的情況。
　　 方法：
　　 1.大鼠原代初生工作心肌細(xì)胞的獲取、

4、培養(yǎng)、標(biāo)記及過氧化氫處理；
　　 2.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及造血干細(xì)胞的獲取、培養(yǎng)、鑒定；
　　 3.TUNEL檢測凋亡；
　　 4.Annexin V檢測凋亡；
　　 5.小鼠急性心肌梗死模型的建立、細(xì)胞移植及心臟消化。
　　 結(jié)果：
　　 1.氧化應(yīng)激作用造成心肌細(xì)胞凋亡（TUNEL及Annexin V檢測）：
　　 1）心肌細(xì)胞經(jīng)過過氧化氫處理后，凋亡明顯比對照組（未經(jīng)過氧化

5、氫處理）多，P<0.05；
　　 2）25mmol/L與50mmol/L過氧化氫造成心肌細(xì)胞凋亡的效果相當(dāng)，P>0.05；
　　 3）心肌細(xì)胞經(jīng)過過氧化氫處理后，分別在48小時(shí)、72小時(shí)與96小時(shí)后檢測其凋亡情況，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，P>0.05；
　　 2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與氧化應(yīng)激受損的心肌細(xì)胞融合（熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀）：
　　 1）熒光顯微鏡：
　　 a.細(xì)胞固定及熒光染色后于熒光顯微鏡下

6、觀察發(fā)現(xiàn)融合細(xì)胞；
　　 b.活細(xì)胞于熒光顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察：心肌細(xì)胞自融合；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自融合；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與心肌細(xì)胞融合；
　　 2）流式細(xì)胞儀：
　　 a.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞只與氧化應(yīng)激受損的心肌細(xì)胞融合（過氧化氫作用組），不與沒氧化應(yīng)激的心肌細(xì)胞融合（對照組），P<0.05；
　　 b.兩種細(xì)胞的融合率跟隨過氧化氫濃度梯度變化而變化；
　　 c.兩種細(xì)胞的融合率跟隨共培養(yǎng)時(shí)間長度變化而

7、變化。
　　 3.氧化應(yīng)激受損的心肌細(xì)胞通過與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞融合而改善生存（TUNEL 及Annexin V檢測）：
　　 1) TUNEL：
　　 共培養(yǎng)組心肌細(xì)胞的凋亡率（19％）明顯低于對照組（非共培養(yǎng)組）（8.4％）,降低55.8％，P<0.05；
　　 2) Annexin V:
　　 a.共培養(yǎng)組在共培養(yǎng)48、72及96小時(shí)后心肌細(xì)胞的凋亡率分別是9.3％，7.6％，5.6％，低于對

8、照組（非共培養(yǎng)組）（11.9％），分別降低了：21.8％，36.％，52.9％，P<0.05；
　　 b.兩種細(xì)胞融合率與心肌細(xì)胞凋亡率之間的相關(guān)性：心肌細(xì)胞的凋亡率隨著融合率的升高而降低，相關(guān)系數(shù)R2=0.9901。
　　 4.氧化應(yīng)激受損的心肌細(xì)胞與骨髓造血干細(xì)胞融合（熒光顯微鏡及流式細(xì)儀）：
　　 1）造血干細(xì)胞的鑒定：
　　 從免疫磁性細(xì)胞分離法獲得的骨髓造血干細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，CD90.1陽

9、性率是98％；
　　 2) 熒光顯微鏡：
　　 細(xì)胞固定及熒光染色后于熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)融合細(xì)胞。
　　 3）流式細(xì)胞儀：
　　 a.骨髓造血干細(xì)胞與氧化應(yīng)激受損的心肌細(xì)胞融合，不與沒氧化應(yīng)激的心肌細(xì)胞融合（對照組），P<0.05；
　　 b.骨髓造血干細(xì)胞與氧化應(yīng)激受損的心肌細(xì)胞的融合率（10.7％）高于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與與氧化應(yīng)激受損的心肌細(xì)胞的融合率（7.9％），P<0.05；
　　

10、 5.氧化應(yīng)激受損的心肌細(xì)胞通過與骨髓造血干細(xì)胞融合而改善生存（Annexin V）：
　　 1) 氧化應(yīng)激受損的心肌細(xì)胞與骨髓造血干細(xì)胞共培養(yǎng)組心肌細(xì)胞的凋亡率（6.5％）低于非共培養(yǎng)組（10.4％），降低了37.5％，P<0.05；
　　 2) 氧化應(yīng)激受損的心肌細(xì)胞通過與骨髓造血干細(xì)胞融合而改善生存的效果等同于與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞融合而改善生存的效果。P>0.05。
　　 6.只有受損的心肌工作細(xì)胞才與骨髓

11、間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生融合（流式細(xì)胞儀）：
　　 氧化應(yīng)激受損的心血管平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的融合率均為零。
　　 7.細(xì)胞因子TNF-α、IL-11、SCF能影響受損心肌與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的融合:
　　 1)TNF-α組的融合率（5.7％）較對照組（沒加入細(xì)胞因子組）的融合率（7.9％）降低，P<0.05；
　　 2)IL-11組的融合率（10.2％）較對照組增高，P<0.05；
　　

12、 3)SCF組的融合率（11.2％）較對照組增高，P<0.05。
　　 8.活體實(shí)驗(yàn)證明了受損心肌細(xì)胞與骨髓干細(xì)胞發(fā)生融合的現(xiàn)象（流式細(xì)胞儀）：
　　 1) 小鼠心臟接受LAD結(jié)扎術(shù)后，于心肌直接注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，其融合率達(dá)8.8％；
　　 2) 小鼠心臟未接受LAD結(jié)扎術(shù)，開胸后于心肌直接注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，其融合率達(dá)4.7％；
　　 3) 小鼠心臟接受LAD結(jié)扎術(shù)后，于心肌直接注射溶液，其融合

13、率為0.03％。各組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1.骨髓干細(xì)胞（骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞）與氧化應(yīng)激受損的心肌細(xì)胞（主要是工作細(xì)胞）融合，并且使心肌細(xì)胞減少凋亡、改善生存。
　　 2.細(xì)胞融合可能是組織應(yīng)對損傷的一種修復(fù)方式。治療細(xì)胞的來源主要是骨髓干細(xì)胞，也可能來自組織干細(xì)胞。細(xì)胞融合有助于解釋干細(xì)胞轉(zhuǎn)化及修復(fù)損傷的作用。
　　 3.活體實(shí)驗(yàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與心肌細(xì)胞