多聚唾液酸修飾聚己內酯納米纖維三維支架的脊髓損傷治療研究.pdf

1、抑制繼發(fā)性損傷和恢復神經系統(tǒng)受損通路是治療脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)的基本策略。多聚唾液酸(Polysialic acid，PSA)是一種內源性多糖聚合物，與神經細胞黏附因子結合后，促進細胞遷移、突觸形成、神經元和髓鞘再生等，在中樞神經系統(tǒng)的受損通路修復中起重要作用。本研究采用PSA與生物可降解材料聚己內酯(Polycaprolactone，PCL)復合，選擇腎上腺皮質激素藥物甲基潑尼松龍(Methylpr

2、ednisolone，MP)為治療藥物，采用靜電紡絲技術分別制備PCL、PCL/MP、PCL/PSA、PCL/MP/PSA四種納米纖維三維支架。研究電紡參數(shù)(PCL濃度、溶劑配比、PSA濃度)對纖維形貌和直徑的影響，研究表明隨著PCL濃度的增加和高揮發(fā)性溶劑(丙酮)比例的上升，纖維串珠狀結構減少、直徑增加，隨著PSA濃度的增加，纖維直徑減少，并確定PCL濃度150 mg/mL、PSA濃度15 mg/mL、溶劑(N，N-二甲基甲酰胺∶丙酮

3、=1∶1，v/v)為最理想的納米纖維三維支架參數(shù)，在此參數(shù)下PCL、PCL/MP、PCL/PSA、PCL/MP/PSA四種納米纖維的直徑分別為564.59±141.43 nm、512.85±69.85nm、500.34±150.7 nm、421.09±57.4 nm。采用紅外分光光度法分析納米纖維三維支架組成，研究發(fā)現(xiàn)PCL、MP、PSA制備成膜后特征峰良好未發(fā)生明顯偏移，表明三種組分保持物理性混合。以pH7.4 PBS為釋放介質研究納

4、米纖維三維支架的體外釋藥行為，研究發(fā)現(xiàn)PSA含量增加會加快MP釋放速率，PSA濃度15 mg/ml時PCL/MP/PSA納米纖維三維支架12h內MP累積釋放量達96％。以pH7.4 PBS為介質研究納米纖維三維支架的體外降解特性并采用掃描電子顯微鏡(Scanning electron telescope，SEM)觀察纖維形貌，研究發(fā)現(xiàn)納米纖維三維支架24h內降解組分主要為MP和PSA，PCL/MP/PSA纖維表面由于MP和PSA降解出現(xiàn)

5、大量空洞狀結構;PCL組分降解緩慢，可以長期維持支架結構的穩(wěn)定，4w后部分纖維發(fā)生斷裂。
　　本研究主要內容包括：⑴以原代星形膠質細胞為模型，分別采用四唑鹽(3-(4，5-dimethylthiazolyl-2)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)比色法和SEM研究納米纖維三維支架的細胞毒性和相容性，結果顯示細胞與PCL、PCL/MP、PCL/PSA、PCL/MP/PSA四種納米纖維三維支架共

6、孵育2d后細胞存活率均大于80％，7d后細胞在PCL/MP/PSA納米纖維三維支架表面緊密黏附并深入深層孔隙結構生長，表明納米纖維三維支架具有良好的生物安全性和細胞相容性。⑵以雌性SD大鼠為模型動物，采用脊髓全橫斷法建立SCI模型并在脊髓缺損處移植納米纖維三維支架。選擇腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)和細胞凋亡蛋白Caspase-3為檢測指

7、標研究納米纖維三維支架對脊髓繼發(fā)性損傷的抑制作用。術后24 h，PCL、PCL/PSA組與SCI組(創(chuàng)傷對照組)相比TNF-α、 IL-6、Caspase-3含量無顯著性差異;而PCL/MP、PCL/MP/PSA組與SCI組相比TNF-α、IL-6、Caspase-3含量顯著降低，表明應用MP治療脊髓損傷可抑制早期損傷部位TNF-α、 IL-6和Caspase-3蛋白表達，減輕繼發(fā)性損傷。⑶以雌性SD大鼠為模型動物，采用脊髓全橫斷法建立

8、SCI模型并在脊髓缺損處移植納米纖維三維支架。采用Basso，Beattie and Bresnahan(BBB)運動學功能評分考察脊髓損傷大鼠的運動功能。結果顯示，術后7w與SCI組相比，各治療組BBB評分均有顯著提高，PCL/MP/PSA組的運動學功能恢復狀況顯著優(yōu)于其他各治療組，表明MP和PSA聯(lián)合治療效果最佳。術后7 w，取脊髓斷端組織制備石蠟切片進行LFB染色并采用透射電子顯微鏡(Transmission electron t

9、elescope，TEM)觀察組織超微結構，PCL/MP/PSA組髓鞘數(shù)目、直徑及板層狀結構完整性顯著優(yōu)于其他各組。采用免疫組織化學法和免疫熒光法研究神經元和NF200、GFAP蛋白表達，PCL/MP/PSA組與其他各組相比神經元數(shù)量和NF200含量顯著增加，GFAP含量顯著降低，表明MP和PSA聯(lián)合治療可以有效提高神經元和軸突存活率，并抑制星形膠質細胞反應性增生。進一步采用免疫熒光法研究Iba1蛋白表達，PCL、PCL/PSA組與SC

10、I組相比Iba1含量無顯著性差異; PCL/MP、PCL/MP/PSA組與SCI組相比Iba1含量顯著降低，應用MP治療脊髓損傷可抑制損傷部位小膠質細胞活化。⑷PCL/MP/PSA納米纖維三維支架可以發(fā)揮MP和PSA的聯(lián)合治療效果，有效抑制脊髓損傷后急性炎癥反應和細胞凋亡蛋白Caspase-3表達，改善脫髓鞘化并抑制星形膠質細胞活化增殖，提高神經元和軸突生存率，最終改善脊髓損傷后大鼠的運動學功能，為組織工程支架應用于脊髓損傷的修復治療提