PTPN12的晶體結(jié)構(gòu)和底物特異性.pdf

1、PTPN12基因最初克隆于1992年，其編碼的PTPN12蛋白是非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶亞家族的成員之一，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。PTPN12全長(zhǎng)共780個(gè)氨基酸殘基，分子量為112kD，包括位于N端的催化結(jié)構(gòu)域和位于C端的PEST結(jié)構(gòu)域，廣泛表達(dá)于多種組織和細(xì)胞中，特別是在造血系統(tǒng)中表達(dá)量比較高。PTPN12在胚胎發(fā)育早期開始表達(dá)，并且在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮必不可少的作用。敲除PTPN12基因，小鼠可以形成正常的原腸胚和卵黃囊，但是后續(xù)發(fā)育

2、缺陷導(dǎo)致小鼠在胚胎發(fā)育早期死亡。磷酸酶PTPN12底物眾多，酶活力較強(qiáng)，通過去磷酸化多種底物而在細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、免疫應(yīng)答、胚胎發(fā)育、破骨細(xì)胞分化等多種生理過程中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用。最近的研究表明，PTPN12是三陰性乳腺癌的抑制因子。在三陰性乳腺癌患者體內(nèi)PTPN12往往低表達(dá)或者存在失活突變，喪失了對(duì)EGFR、HER2和PDGFR等底物的去磷酸化能力，導(dǎo)致EGFR、HER2和PDGFR等多條原癌通路激活，進(jìn)而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)

3、展。條件性敲除小鼠乳腺上皮細(xì)胞中的尸TPN12基因，會(huì)加速乳腺癌的惡性發(fā)展以及乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。雖然已有大量的研究表明PTPN12通過調(diào)控底物的磷酸化在多種生理過程中發(fā)揮非常重要的作用，但是其底物特異性以及分子機(jī)制還十分不清楚。
　　本文通過懸滴法結(jié)晶獲得了PTPN12催化結(jié)構(gòu)域K61R突變體的蛋白質(zhì)晶體，經(jīng)解析獲得分辨率為2.4埃的PTPN12催化結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)。通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)和酶學(xué)研究，闡明了PTPN12的底物特異性，并且揭示

4、了決定PTPN12底物特異性的兩個(gè)結(jié)構(gòu)特征:pY+1位置的結(jié)合口袋和位于蛋白表面的堿性氨基酸殘基。PTPN12結(jié)構(gòu)的可塑性區(qū)域以及位于表面的關(guān)鍵氨基酸殘基對(duì)于PTPN12識(shí)別HER2的不同磷酸化位點(diǎn)非常重要。我們進(jìn)一步結(jié)合細(xì)胞學(xué)研究，闡明了PTPN12底物特異性對(duì)細(xì)胞功能的影響。除此之外，通過對(duì)晶體結(jié)構(gòu)的研究和體外磷酸化實(shí)驗(yàn)，本文發(fā)現(xiàn)在PTPN12催化結(jié)構(gòu)域存在一個(gè)可以被CDK2磷酸化的位點(diǎn)S19。綜上所述，我們的研究結(jié)果不僅揭示了PT

5、PN12去磷酸化底物的工作原理以及對(duì)乳腺癌細(xì)胞功能的影響，同時(shí)也為設(shè)計(jì)PTPN12的特異性抑制劑提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
　　研究目的：
　　通過酶學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究，解析PTPN12催化結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)，闡明PTPN12的底物特異性以及分子機(jī)制，探究PTPN12底物特異性對(duì)乳腺癌細(xì)胞功能的影響。
　　研究方法：
　　1)質(zhì)粒構(gòu)建
　　將PTPN12催化結(jié)構(gòu)域(1-305)克隆到pET-15b原核表達(dá)

6、載體上，N端His標(biāo)簽，通過Quick Change的方法構(gòu)建PTPN12點(diǎn)突變質(zhì)粒。將PTPN12催化結(jié)構(gòu)域和全長(zhǎng)分別克隆到pcDNA3.1真核表達(dá)載體上，C端Flag標(biāo)簽。將CDK2全長(zhǎng)克隆到pGEX-6P-2原核表達(dá)載體上，N端GST標(biāo)簽。
　　2)蛋白表達(dá)與純化
　　將His標(biāo)簽PTPN12催化結(jié)構(gòu)域野生型和突變體的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)大腸桿菌BL21(DE3)菌株，IPTG低溫誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，分別經(jīng)Ni-beads和分子篩

7、純化使蛋白純度高于95％，經(jīng)超濾濃縮獲得濃度為8-10mg/ml的蛋白。His標(biāo)簽BDP1和Lyp磷酸酶催化結(jié)構(gòu)域的蛋白表達(dá)和His-PTPN12催化結(jié)構(gòu)域的蛋白表達(dá)、純化方法相同。將GST標(biāo)簽的CDK2全長(zhǎng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)大腸桿菌BL21(DE3)菌株，經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，GST-beads純化獲得純度高于90％的蛋白，經(jīng)超濾濃縮使蛋白濃度為8-10mg/ml。
　　3)蛋白結(jié)晶及結(jié)構(gòu)解析
　　使用純度高于95％，濃度為

8、8-10mg/ml的PTPN12催化結(jié)構(gòu)域野生型蛋白和K61R突變體蛋白，分別通過懸滴法結(jié)晶并靜置于4℃培養(yǎng)箱中。雖然野生型蛋白結(jié)晶沒有成功，但是三個(gè)月后獲得了His-PTPN12催化結(jié)構(gòu)域K61R突變體的蛋白質(zhì)單晶，通過X射線衍射收集數(shù)據(jù)，經(jīng)分子置換以及軟件優(yōu)化獲得了分辨率為2.4埃的PTPN12催化結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)。
　　4)酶活力檢測(cè)
　　使用96孔酶標(biāo)板，采用終點(diǎn)讀數(shù)法分別檢測(cè)PTPN12、BDP1和Lyp對(duì)小分子底物

9、pNPP、DiFMUP和OMFP的酶活力，使用GraphPad Prism5軟件擬合米氏方程并且計(jì)算出酶活常數(shù)Km和kcat。使用96孔酶標(biāo)板，通過無機(jī)定磷法檢測(cè)PTPN12野生型和突變體蛋白對(duì)于多種磷酸化酪氨酸短肽的酶活力，使用GraphPad Prism5軟件擬合米氏方程并且計(jì)算出酶活常數(shù)Km和kcat。
　　5)免疫共沉淀
　　在HEK-293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染CDK2質(zhì)粒和PTPN12質(zhì)粒，經(jīng)免疫共沉淀，檢測(cè)CDK2對(duì)PT

10、PN12的磷酸化作用。在HEK-293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染CDK2質(zhì)粒和PTPN12-S19A突變體質(zhì)粒，確定出S19是CDK2磷酸化PTPN12的主要位點(diǎn)。
　　6)細(xì)胞功能檢測(cè)
　　在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中分別過表達(dá)PTPN12野生型以及不同突變體的質(zhì)粒，給予EGF刺激之后，通過MTT比色法檢測(cè)活細(xì)胞的數(shù)量，從而檢測(cè)PTPN12野生型以及不同突變體對(duì)于MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。
　　在MDA-

11、MB-231乳腺癌細(xì)胞中分別過表達(dá)PTPN12野生型以及不同突變體的質(zhì)粒，在transwell上室中使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)已轉(zhuǎn)染的乳腺癌細(xì)胞，在下室中加入含EGF的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞從上室向下室遷移，通過結(jié)晶紫染色并計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)目，檢測(cè)PTPN12野生型以及不同突變體對(duì)于乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響。
　　在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染Ub和PTPN12野生型以及不同突變體催化結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒，通過免疫共沉淀的方法檢測(cè)PT

12、PN12野生型及不同突變體對(duì)HER2泛素化的影響。
　　7)體外磷酸化實(shí)驗(yàn)
　　構(gòu)建25μl反應(yīng)體系，在MOPS緩沖溶液中37℃共孵育GST-CDK2蛋白、cyclinA蛋白、His-PTPN12催化結(jié)構(gòu)域蛋白和ATP，磷酸化反應(yīng)以最后加入CDK2蛋白為起始，以加入loading buffer為反應(yīng)終止。通過Western Blotting，使用CDKS-substrate antibody檢測(cè)PTPN12的磷酸化。