聚酮合成中酮基還原酶的底物特異性和立體選擇性研究

1、索取號(hào)：Q554密級(jí)：公開碩士學(xué)位論文聚酮合成中酮基還原酶的底物聚酮合成中酮基還原酶的底物特異性和立體選擇性研究特異性和立體選擇性研究研究生：生：孫瀟慧孫瀟慧指導(dǎo)教師：指導(dǎo)教師：楊革楊革教授教授鄭艦艇鄭艦艇研究員研究員培養(yǎng)單位：培養(yǎng)單位：生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一級(jí)學(xué)科：一級(jí)學(xué)科：生物學(xué)生物學(xué)二級(jí)學(xué)科：二級(jí)學(xué)科：微生物學(xué)微生物學(xué)完成時(shí)間：完成時(shí)間：20152015年0404月1010日答辯時(shí)間：答辯時(shí)間：20152015年0606月06

2、06日萬方數(shù)據(jù)摘要I摘要近年來，手性藥物在醫(yī)藥市場(chǎng)占有越來越重的份額，它巨大的應(yīng)用價(jià)值得到了各國科學(xué)家的關(guān)注，成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。手性醇及其衍生物是合成手性藥物的前體，酮基化合物的不對(duì)稱還原是制備手性醇的重要手段。相對(duì)于傳統(tǒng)的化學(xué)還原，酶法還原因具有反應(yīng)條件溫和、立體選擇性好、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到大家的重視，而酶法還原最為關(guān)鍵的就是尋找合適的還原酶。聚酮類化合物是由微生物或植物產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物，是臨床藥物的重要來源。其

3、生物合成過程中涉及多步由酮還原酶（keteductase，KR）催化的酮基立體特異性還原，分別由聚酮合酶中酮還原酶域和聚酮后修飾酮還原酶負(fù)責(zé)。本文研究了多個(gè)不同聚酮生物合成途徑中的KR作為生物催化劑合成手性醇的潛力，鑒定了其底物寬泛性，并對(duì)其立體特異性進(jìn)行深入研究，同時(shí)試圖利用X射線晶體衍射技術(shù)解析酮還原酶的三維結(jié)構(gòu)，以確定催化中心參與底物結(jié)合的氨基酸殘基，研究結(jié)果如下：1、三種不同聚酮合酶中的KR結(jié)構(gòu)域（BacKR1、TylKR1和E

4、ryKR1），對(duì)八種不同底物的還原實(shí)驗(yàn)顯示不同KR具有不同的底物譜和立體特異性，三種酶對(duì)天然底物類似物有一定的催化活性，不同的是BacKR1對(duì)環(huán)己酮和4氯苯乙酮有一定的催化活性，TylKR1對(duì)環(huán)己酮、苯乙酮、4氯苯乙酮、4氟苯乙酮和乙酰乙酸乙酯有一定的催化活性，EryKR1對(duì)環(huán)己酮、苯乙酮和乙酰乙酸乙酯有一定的催化活性，三種酶在還原酮類底物的能力各具優(yōu)勢(shì)。此外，分別對(duì)TylKR1和EryKR1的關(guān)鍵性氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變后，TylKR1活

5、性明顯降低，但都產(chǎn)生了2R，3R構(gòu)型的產(chǎn)物；而EryKR1的構(gòu)型突變后有所改變，不僅有產(chǎn)生2S，3R構(gòu)型還產(chǎn)生了2R，3R構(gòu)型的產(chǎn)物，突變位點(diǎn)的改變確實(shí)影響了酶的立體選擇性，關(guān)鍵位點(diǎn)的改變亦影響了酶的活性。2、采用親和層析和凝膠過濾層析法得到四種后修飾聚酮酮還原酶DnrU、DnrE、MeiF和Red1，利用NADPH消耗法對(duì)四個(gè)蛋白進(jìn)行底物特異性研究，最終發(fā)現(xiàn)MeiF和DnrU能夠催化非天然底物，其中MeiF對(duì)芳香酮具有較高的催化活性，